欣胃颗粒及其拆方对胃癌前病变大鼠Axin、APC基因表达影响的研究 Δ

张杨，沈文娟，谢晶日，王静滨，刘朝霞，孙涛，张冰

黑龙江中医药大学附属第一医院1肝脾胃科，2妇科，哈尔滨1500360

胃癌前病变（precancerous lesions of gastric carcinoma，PLGC）是从病理学角度提出的概念，指胃黏膜具有恶性转化可能性的病理学改变，其包括慢性萎缩性胃炎并伴有肠上皮化生和异型增生的一种病理状态。根据Correa级联学说，胃黏膜癌变是多阶段的动态演变过程，通常要经历一个相对较长的PLGC阶段，此阶段是胃癌转变的重要节点，并具有双向转化的特点[1]。由于PLGC具有双向转变的特点，所以其在胃癌的发生、发展中起着关键性作用。相关研究表明，胃癌的发生与不恰当地激活WNT信号转导通路密切相关[2]。与西医治疗相比，中医药治疗PLGC的优势突出[3-4]，且起到细胞逆转及腺体重建的作用。本研究基于前期多项实验研究及临床观察的基础上[5-7]，探究欣胃颗粒及其拆方干预对PLGC大鼠WNT信号通路中轴蛋白（Axin）和结肠腺瘤样息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）表达的影响，揭示欣胃颗粒的作用机制以及拆方后各法之间的协调作用，旨在为优化组方及胃癌的有效防治提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取Wistar健康雄性大鼠[由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCKK（黑）2008004]360只，体重为（200±20）g。

1.2 实验药物及试剂

欣胃颗粒：每剂由黄芪（每袋10 g）2.5袋；白术（每袋10 g）2.0袋；石斛（每袋10 g）1.5袋；沙参（每袋10 g）1.5袋；三棱（每袋10 g）1.5袋；莪术（每袋10 g）1.5袋；蛇莓（每袋10 g）1.5袋；半枝莲（每袋15 g）2.5袋组成，均购自江阴天江药业有限公司。胃复春（由香茶菜、红参、枳壳等组成）购自杭州胡庆余堂药业。N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）购自日本东京化成工业株式会；Axin、APC试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 方法

1.3.1 分组 将360只Wistar健康雄性大鼠适应性喂养7天后，根据随机数字表法分为空白组、模型组、胃复春组和中药组，其中中药组又分为中药单法组[益气法（药用黄芪、白术）、养阴法（药用石斛、沙参）、化瘀法（药用三棱、莪术）、解毒法（药用蛇莓、半枝莲）4组]、中药双法组[益气养阴法（药用黄芪、白术、石斛、沙参）、益气化瘀法（药用黄芪、白术、三棱、莪术）、益气解毒法（药用黄芪、白术、蛇莓、半枝莲）、养阴化瘀法（药用石斛、沙参、三棱、莪术）、养阴解毒法（药用石斛、沙参、蛇莓、半枝莲）、化瘀解毒法（药用三棱、莪术、蛇莓、半枝莲）6组]、中药三法组[益气养阴化瘀法（药用黄芪、白术、石斛、沙参、三棱、莪术）、益气养阴解毒法（药用黄芪、白术、石斛、沙参、蛇莓、半枝莲）、益气化瘀解毒法（药用黄芪、白术、三棱、莪术、蛇莓、半枝莲）、养阴化瘀解毒法（药用石斛、沙参、三棱、莪术、蛇莓、半枝莲）4组]、中药四法组[益气养阴化瘀解毒法（药用黄芪、白术、石斛、沙参、三棱、莪术、蛇莓、半枝莲）]，共计18组，每组20只。

1.3.2 模型制备 根据MNNG自由饮用，雷尼替丁标准饲料喂养，热盐水灌胃，同时配合饥饱失常的复合造模方法构建胃癌前病变动物模型。模型组、胃复春组和中药各组大鼠给予100 μg/ml MNNG溶液作为饮用水自由饮用，含0.3 g/kg雷尼替丁的标准饲料喂养，60℃150 g/L热盐水每日按10 ml（/kg·d）灌胃，同时配合饥饱失常（2天饱食，1天禁食），连续16周造成大鼠PLGC病变模型。空白组大鼠正常进食进水。

1.3.3 药物干预PLGC大鼠造模成功后，胃复春组、中药各组大鼠分别给予相应药物干预，具体方法：每日下午给予各组大鼠按10 ml（/kg·d）相应的药物灌胃，胃复春组给予浓度为0.04 g/ml的胃复春制剂，中药各组给予浓度为1.5 g/ml的对应组方颗粒，模型组和空白组大鼠给予0.9%的生理盐水灌胃，连续给药16周。

1.3.4 胃黏膜组织中Axin、APC基因相对表达量的检测 药物干预结束后，所有大鼠均禁食24 h（自由饮水），然后全部乌拉坦麻醉，迅速剖腹取胃，沿胃大弯剪开，采用预冷的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗，将胃组织平铺于冰盘上，肉眼观察了解胃黏膜的变化情况后，于胃窦部剪取黄豆大组织2块，液氮处理后于-86℃超低温保存，将胃黏膜组织按照RNeasy Mini Kit的操作步骤提取细胞总RNA，同时按照离心柱型高纯总RNA快速提取试剂盒中的步骤对提取的总RNA进行纯化。将获取的总RNA经逆转录聚合酶链反应获取实验所需的cDNA。引物序列为：βactin上游引物：3'-CGCGAGAAATGACCCAGAT-5'，下游引物：3'-GTACGGCCAGAGGCGTACAG-5'；Axin上游引物：3'-CCACAGAAATAGTAGGCCACA-5'，下 游 引 物 ：3'-GGAGGAAGAAGAAAAGAGAGC-5'；APC上游引物：3'-GATAAGGACGATATGTCACG-5'，下 游 引 物 ：3'-TGAATGATGTTGTGGAGGGC-5'。 按 照 Takara 试剂盒说明书进行操作，20 μl反应体系扩增，反应条件为95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s进行变性、退火、延伸，共40个循环，反应结束后对每组获取的Ct值，应用2-△△Ct方法定量检测基因的表达情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 15.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1胃黏膜组织中AxinmRNA、APCmRNA表达情况的比较

与空白组比较，模型组、胃复春组和中药各组大鼠胃黏膜组织中AxinmRNA、APCmRNA的相对表达量均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，胃复春组和中药各组大鼠胃黏膜组织中AxinmRNA、APCmRNA相对表达量均增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与胃复春相比较，中药单法组大鼠胃黏膜组织中AxinmRNA相对表达量均降低，中药三法组和中药四法组大鼠胃黏膜组织中AxinmRNA相对表达量均增高，中药单法组、中药双法组、中药三法组和中药四法组大鼠胃黏膜组织中APCmRNA的相对表达量均增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与中药四法组比较，中药单法组、中药双法组、中药三法组大鼠胃黏膜组织中AxinmRNA、APCmRNA的相对表达量均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组别大鼠胃黏膜组织中Axin mRNA、APC mRNA相对表达量的比较（±s）

表1 不同组别大鼠胃黏膜组织中Axin mRNA、APC mRNA相对表达量的比较（±s）

注：a与空白组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05；c与胃复春组比较，P＜0.05；d与益气养阴化瘀解毒组比较，P＜0.05；实验过程中大鼠有死亡，故部分组别大鼠例数小于20例

组别空白组（n=19）模型组（n=16）胃复春组（n=20）中药单法组益气组（n=20）养阴组（n=20）化瘀组（n=20）解毒组（n=20）中药双法组益气养阴组（n=19）益气化瘀组（n=19）益气解毒组（n=18）养阴化瘀组（n=19）养阴解毒组（n=18）化瘀解毒组（n=18）中药三法组益气养阴化瘀组（n=16）益气养阴解毒组（n=18）益气化瘀解毒组（n=18）养阴化瘀解毒组（n=18）中药四法组益气养阴化瘀解毒组（n=18）Axin mRNA 468.87±9.57 103.03±6.32a 277.86±15.27a b APC mRNA 1.06±0.07 0.09±0.01a 0.13±0.02a b 213.95±16.84a b c d 211.26±17.88a b c d 208.67±30.34a b c d 206.12±21.43a b c d 0.26±0.02a b c d 0.25±0.03a b c d 0.26±0.03a b c d 0.26±0.04a b c d 247.60±4.39a b d 230.49±31.62a b d 260.73±28.06a b d 246.53±23.40a b d 268.55±21.35a b d 261.39±24.40a b d 0.32±0.01a b c d 0.33±0.03a b c d 0.34±0.0a b c d 0.34±0.04a b c d 0.34±0.03a b c d 0.35±0.03a b c d 315.05±13.00a b c d 332.70±7.27a b c d 306.96±12.27a b c d 347.48±25.77a b c d 0.46±0.05a b c d 0.46±0.04a b c d 0.49±0.02a b c d 0.46±0.02a b c d 457.10±9.44a b c 0.94±0.04a b c

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。国家癌症中心报告显示，2015年中国胃癌发病率居恶性肿瘤第2位，较2013年明显升高，病死率居恶性肿瘤第2位[8]。PLGC是正常黏膜向胃癌恶性转化的一个重要阶段，且具有双向转变的特点。因此，PLGC大鼠模型的成功建立与探索PLGC的发病机制、进展过程及寻找行之有效的预防和治疗方法意义重大。WNT信号转导通路参与调节细胞生长、增殖、分化及凋亡等过程，细胞发育、形态改变以及相邻细胞之间的相互作用均与WNT信号通路密不可分。相关研究表明，WNT信号转导通路失衡、异常活化是胃癌发生的重要影响因素[8-12]，信号蛋白、跨膜受体、胞质蛋白和核内转录因子等是WNT信号通路的异常活化因子。而Axin和APC蛋白是WNT信号转导通路中的重要组成因子，其活性异常与胃癌的发生密切相关。WNT信号通路发生缺陷时可导致发育缺陷，而癌基因、抑癌基因或WNT信号通路成分的突变使该通路不恰当地激活而导致消化道肿瘤发生，而在此过程中，Axin、APC蛋白呈现低表达状态。

PLGC主要归属中医学“痞满”范畴，据相关文献报道，中医药治疗PLGC的疗效显著，并且可以达到细胞逆转和腺体重建的作用[13-15]。本研究旨在对PLGC大鼠进行干预治疗，研究欣胃颗粒及其拆方后“益气”“养阴”“化瘀”“解毒”各法及其组合对WNT信号通路关键因子AxinmRNA和APCmRNA表达的影响，有望优化药物组方，选择可靠、有效的切入点，对肠上皮化生、异型增生等PLGC进行阻断和干预治疗。本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织中AxinmRNA和APCmRNA相对表达量均降低（P＜0.05）；但中药干预后，胃复春组和中药各组大鼠胃黏膜组织中AxinmRNA和APCmRNA相对表达量均升高（P＜0.05），而且其调控改善效果由低到高依次为中药单法组、中药双法组、中药三法组、中药四法组，表明中药各法间可能存在协同作用，而中药益气养阴化瘀解毒四法组的调控作用最佳。

综上所述，PLGC的基本病理机制多为本虚标实、虚实夹杂，中药益气养阴化瘀解毒法可显著改善PLGC的状态，对WNT信号通路上的Axin和APC因子的表达具有显著调节作用，此作用靶点可作为中药益气养阴化瘀解毒法防治PLGC的机制之一，这也可为将来进一步的实验研究提供思路和研究基础。