葛根黄酮对癫痫大鼠海马NF-κB mRNA和IL-10 mRNA表达的影响

何小群　黄建敏　刘国军　李津　冯雪萍

【摘要】 目的：探讨葛根黄酮对癫痫大鼠脑神经的保护作用。方法：制备葛根黄酮溶液，通过腹腔注射亚惊厥剂量戊四氮构建癫痫大鼠模型，将大鼠分为对照组、PZT模型组和葛根黄酮干预组，在7、14、21、28 d分别取大鼠海马组织进行实时荧光定量PCR检测NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表达。结果：随着给药时间的延长，与对照组比较，PZT模型组各时间点NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表达增高，差异有统计学意义（P<0.01），葛根黄酮干预组在21、28 d NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表达量增高，差异有统计学意义（P<0.01）;且与模型组比较，干预组在21、28 d NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表达量降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：葛根黄酮溶液对癫痫大鼠脑损伤具有一定的保护作用。

【关键词】 葛根黄酮; 癫痫; 大鼠; 核转录因子-κB; 白细胞介素-10

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.10.004 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）10-000-03

Effects of Pueraria Flavones on Expressions of Neclear Factor-κB mRNA and IL-10 mRNA in Hippocampus of Epileptic Rats/HE Xiaoqun，HUANG Jianmin，LIU Guojun，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（10）：-10

【Abstract】 Objective：To investigate the protective effects of Pueraria Flavones on brain nerve in epileptic rats.Method：Pueraria Flavones solution was prepared，and the epileptic rat model was constructed by intraperitoneal injection of Pentylenetetrazol.The rats were divided into control group，PZT model group and Pueraria Flavone intervention group.The hippocampal tissues of rats were extracted on 7 d，14 d，21 d and 28 d respectively for real-time quantitative PCR detection of the expression of NF-κB mRNA and IL-10 mRNA.Result：With the extension of drug administration time，compared with the control group，the expression of NF-κB mRNA and IL-10 mRNA in the PZT model group increased at each time point，the differences were statistically significant（P<0.01）.And compared with the model group，the expression level of NF-κB mRNA and IL-10 mRNA in the Pueraria Flavones intervention group on 21 d and 28 d were decreased，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：Pueraria Flavones Solution has a protective effect on brain injury of epileptic rats.

【Key words】 Pueraria flavones; Epilepsy; Rat; NF-κB; IL-10

First-authors address：Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

葛根是豆科植物野葛的干燥根莖，其主要成分为异黄酮类化合物[1]，包含葛根素、大豆苷元、大豆苷等，具有广泛的药理学作用，如扩血管、抗衰老、抗血栓、降血糖、神经保护、增强免疫力等。本实验通过腹腔注射亚惊厥剂量戊四氮建立慢性癫痫大鼠模型，以葛根黄酮设组进行干预，检测大鼠海马组织中NF-κB、IL-10的表达在不同时期的变化，首次探讨其对癫痫大鼠脑神经的保护作用，从分子水平研究葛根黄酮对慢性致痫大鼠的干预机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

KQ5200DB型数控超声波清洗器、HH-2K4电热恒温水浴锅、RE-3000A（3L）型旋转蒸发仪、TG16-WS台式高速离心机、722型分光光度计、FA（N）/JA（N）电子天平、ALPHA1-2/LD-plus冷冻干燥机、AB-8型大孔树脂柱。

1.2 动物

SD雄性大鼠80只，体重200～220 g，由右江民族医学院实验动物中心提供。生产许可证号SCXK（桂）2012-0003，动物饲养在SPF级实验室中，自由摄食饮水。

1.3 主要药品与试剂

干燥葛根片购自广西百色市生物制品药店，生产日期：2015年12月15日。戊四氮（PTZ）购自美国Sigma公司;水合氯醛购自依托生物;引物和荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司。

1.4 葛根黄酮的制备、鉴定和测定

制备：干燥葛根片粉碎，过40目筛后，置干燥容器备用。精密称取葛根粉末200 g，加2 000 ml 70%乙醇，密闭浸泡过夜，超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣再加1 500 ml 70%乙醇，超声波提取1.5 h，抽滤，合并两次滤液，旋转蒸发，然后用乙酸乙酯 萃取3次，真空干燥，得到葛根粗制总黄酮粉末。然后将提取得到的粗黄酮化合物在AB-8大孔树脂柱上进行纯化，用500 ml 60%的乙醇洗脱，收集乙醇部分，减压浓缩，在冷冻机中干燥得到纯化后的总黄酮。

鉴定和测定：将纯化后得到的总黄酮取少量溶于1 ml 甲醇溶液试管中，加入浓盐酸2～3滴，在加少量镁粉，观察到玫瑰红色即可确定为红薯叶总黄酮。采用以芦丁为标准品的比色法测定总黄酮含量，将制备所得的葛根黄酮稀释为160 mg/ml备用。

1.5 癫痫模型的建立

SD大鼠80只，随机选取20只作为空白对照组，其余用于制作大鼠癫痫模型。造模方法：每天上午按照35 mg/kg劑量给60只SD大鼠腹腔注射亚惊厥PZT，空白对照组予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射[2]。癫痫等级评分如下：0级表现为无抽搐发作;Ⅰ级表现为面部阵挛，包括眨眼、节奏性咀嚼、动须等;Ⅰ级伴有节奏性点头记为Ⅱ级;Ⅱ级伴有前肢肌阵挛，但后肢能保持直立位可记为Ⅲ级;Ⅲ级伴有后肢直立位记为Ⅳ级;双前肢阵挛明显加重，无法平衡导致跌倒或抽搐死亡记为Ⅴ级。超过4周仍未点燃的大鼠则弃用。

1.6 给药方法

造模大鼠随机平均分为模型组和葛根黄酮干预组，干预组大鼠每天灌胃葛根黄酮（150 mg/100 g）后1 h接着注射PZT，空白对照组和模型组灌胃等剂量的0.9%氯化钠注射液，连续灌胃4周。各组大鼠分别于服药后7、14、21、28 d时间点各随机取5只，用10%水合氯醛溶液麻醉、断头取脑，保持低温条件，快速分离海马，用4 ℃ 0.9%氯化钠注射液洗涤，保存温度为-80 ℃[2]。

1.7 Real-time PCR检测方法

参照Real-time PCR检测试剂盒说明书进行操作，以β-actin为内参。NF-κB、β-actin和IL-10基因引物序列及扩增长度见表1。扩增条件参照说明书执行，最后做溶解曲线分析。采用2-ΔΔct法进行相对定量分析。

1.8 统计学处理

本研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，运用单因素方差分析（LSD法），计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学描述

对照组，注射生理盐水后，状态良好，行为无明显变化，食欲和饮水均正常，体重逐渐增加;PZT模型组，随着注射次数的增加，癫痫发作的大鼠数量增多，发作的等级加重，在第7天后大部分模型组大鼠发作等级都能达到4级及以上，食欲和饮水量下降，精神沉郁，逐渐消瘦，被毛无光泽，对注射操作敏感性增高;葛根黄酮干预组大鼠癫痫发作4级以上要比模型组晚10～12 d，相同时间点癫痫的发作等级也比模型组低，随着灌胃时间的延长，干预组大鼠的精神状态及食欲优于模型组，低于对照组。

2.2 NF-κB mRNA的表达检测结果

与对照组比较，PZT模型组在各个时间点NF-κB mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.01），葛根黄酮干预组在7 d和14 d时NF-κB m RNA表达比较差异无统计学意义（P>0.05），在21 d和28 d时NF-κB mRNA表达量升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与干预组比较，模型组NF-κB mRNA的表达量随着给药时间的延长逐渐增多，均明显高于对照组和干预组，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。

2.3 IL-10 mRNA的表达检测结果

与对照组比较，模型组各个时间点IL-10 mRNA表达量均增高，差异有统计学意义（P<0.01），干预组在21 d和28 d时IL-10 mRNA表达量增高，差异有统计学意义（P<0.01），7 d和14 d时比较差异无统计学意义（P>0.05）;与干预组比较，模型组IL-10 mRNA表达随着给药时间的延长，表达量逐渐增多，均高于对照组和干预组，差异有统计学意义（P<0.01），见表3。

3 讨论

癫痫是一种神经系统疾病，发病机制复杂难治愈。目前认为癫痫发作所引起的脑内炎症反应是导致癫痫发作后脑组织病理改变，特别是海马结构损伤的主要原因之一。癫痫发作时产生的大量氧自由基活化转录NF-κB，NF-κB可协助转录其他许多炎症因子从而对机体造成氧化损伤[3]。NF-κB（核转录因子）是一种具有多向转录调节作用的蛋白质，参与多种基因的转录调控，与炎症、免疫反应以及突触可塑性及细胞的增生、转化和凋亡等多种生理和病理过程密切相关。IL-10是重要的免疫调节因子，它可以抑制NF-κB的活化，其机制可能是抑制大脑皮层神经元兴奋性氨基酸 NMDA 受体的表达，抑制钙离子内流等发挥作用[4]。临床上癫痫患者血清IL-8、IL-10、TNF-α的含量明显高于健康者，提示这些因子与癫痫的发病有关[5]。研究表明NF-κB信号通路在许多细胞因子和炎性介质的基因表达和调控中起着重要作用。其过度表达会导致机体的炎症反应和组织病理损伤[6]，如果有效抑制其过度表达，对癫痫的控制和治疗具有重要的意义。

葛根黄酮药理作用广泛，具有一定的神经保护作用。潘洪平等[7]研究表明葛根素可以减轻缺血性大鼠脑细胞的损伤，提高其热休克蛋白70（HSP70）表达水平，从而起到保护神经细胞的作用。黎荣等[8]使用葛根素干预帕金森病大鼠模型，发现葛根素对6-羟基多巴胺所致PD大鼠黑质组织神经细胞具有保护作用，机制可能与其抑制过氧化应激作用以及调节内源性INOS、CREB蛋白的表达有关。王雅莉等[9]观察不同浓度葛根素对去卵巢大鼠认知功能及海马CA1区、CA3区神经元元电镜下形态的影响，透射电镜结果表明，葛根素在不同浓度范围内，随着浓度的增大，抑制海马神经元细胞凋亡的作用越强，并有一定的剂量依赖关系，发现葛根素可以促进去卵巢大鼠学习记忆功能的恢复，减轻因雌激素缺乏而引起的大鼠海马神经元凋亡作用。金锡姣等[10]使用葛根黄酮干预脑缺血再灌注损伤大鼠，检测大鼠脑组织中一氧化氮（NO）含量及一氧化氮合酶（NOS）活性的变化，结果表明葛根黄酮能降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中NO含量，并抑制NOS活性，对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护作用。梁云星等[11]使用葛根黄酮搽剂治疗神经根型颈椎病大鼠，结果表明葛根黄酮搽剂能有效减轻神经根型颈椎病大鼠的神经根性疼痛，改善受损神经根状态。马麟等[12]通过放射免疫法测得桂枝加葛根汤治疗组可降低PGE2、6-K-PGFla水平，抑制炎症介质生成。

本实验结果表明，PZT模型组随着给药时间的延长，NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表达量逐渐增高，高于对照组和干预组，差异有统计学意义（P<0.01）;通过灌喂葛根黄酮，干预组在第21、28天NF-κB mRNA和IL-10 mRNA的表达量低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），这与已有研究结果IL-10具有抑制NF-κB活化的作用是相吻合的。因此，从本实验可以看出葛根黄酮对大鼠癫痫模型具有一定的保护作用，其保护机制可能是通过上调IL-10的表达抑制氧自由基活化转录NF-κB，

进而抑制大量细胞因子和炎性介质的基因表达，抑制炎症的发展，达到保护脑神经的作用。但其最佳的给药剂量和具体的作用机制还有待于进一步深入研究。

参考文献

[1]李国辉，张庆文，王一涛.葛根的化学成分研究[J].中国中药杂志，2010，35（23）：3156-3160.

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[9]王雅莉，李长天，陈雁飞，等.葛根素对去卵巢大鼠认知功能及海马神经元超微结构的影响[J].中国老年学杂志，2013，33（17）：4203-4205.

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[12]马麟，赵玉堂.桂枝加葛根汤抗炎镇痛作用研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：249-251.