磷受控对酿酒废水-微藻培育耦合体系的影响

余 江 ，陶红群 ，王亚婷 ，王艺蒸 ，彭炜东 ，冉宗信 ，贺玉龙

（1.四川大学建筑与环境学院，四川 成都 610065；2.四川大学新能源与低碳技术研究院，四川 成都 610065；3.成都市环境保护科学研究院，四川 成都 610072）

藻类生物含有丰富的营养成分，在食品、饲料、水产饵料、化工医药等领域具有重要的市场价值，藻类的开发利用已受到世界各国的普遍重视，藻类养殖与资源化利用也已成为一个战略性新兴产业.然而目前在微藻培育方面所面临的主要问题包括藻种筛选、水资源占有和运行成本偏高等.因此如何在资源可持续利用的目标下，解决废水处理和能源开发是当前我们环保行业所需实现的重要课题.研究表明，以废水为培养基培养高附加值微藻的关键和前提是优良藻种的获取[1].

磷作为植物三大必须元素之一，参与植物生长发育的全过程及各种代谢活动，在细胞膜结构、物质代谢以及信号传导、光合作用等方面都起着极为重要的作用[2-3].研究表明微藻吸收磷主要有两种方式，第一种方式是在有氧条件下直接吸收磷酸盐，将其转化为三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和磷脂等；第二种方式主要是通过微藻生长形成的碱性环境，磷酸根与环境中的钙、镁等离子形成沉淀，去除培养液中的总磷.有学者曾指出，当处于缺磷情况时，微藻由于细胞中磷浓度降低，会引起卡尔文（Calvin）循环效率下降、光合磷酸化水平下降、ATP合成减少等情况，从而降低细胞代谢活性、减弱其对外界胁迫的适应能力，继而影响微藻的生长[4-6].在一定浓度范围内，微藻生长与磷浓度呈正相关，但当环境中磷浓度过高时，环境中氮磷比会发生剧烈变化，细胞的生长反而会受到抑制[7].近年来，有关微藻在不同类型废水中的特性研究较少[8-10].本研究采用控制变量法对酿酒废水的总磷浓度进行调控，观察莱茵衣藻和二形栅藻在单一培养和共培养条件下的生长情况，以及对酿酒废水中营养盐的吸收去除效率和藻蛋白质情况，筛选出在酿酒废水下适合微藻生长的总磷浓度，对研究微藻与酿酒废水的耦合培育体系具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用莱茵衣藻（Chlamydoomonas reinhardtii）和二形栅藻（scenedesmus dimorphus）均取自四川大学生命科学学院藻类学藻种室.

1.2 酿酒废水培养基

本实验应用的酿酒废水取自四川省成都市双流区黄甲镇黄甲八仙酒厂出厂水，并用提前灭菌的聚乙烯桶取回.实验前，为除去废水中的悬浮物等物质，对酿酒废水进行多级施加皂土（250.00 ml 液体加入10.00 g 皂土），搅拌10 min、离心处理（4 800 r/min，10 min），调节pH 至中性，再将该废水于121℃高压灭菌30 min，杀死病原微生物，清除对微藻处理酿酒废水效果的干扰，从而降低实验误差.待高压灭菌锅压力表读数降至零后，取出自然冷却，放入4℃冰箱冷却保存，备用.取一定体积未处理与已预处理的酿酒废水，测定其基本理化指标，酿酒废水成分如表1所示.表中，COD 为化学需氧量（chemical oxygen demand），TN 为总含氮量（total nitrogen），TP 为总含磷量（total phosphorus），V/V 为体积比.

表1 酿酒废水成分组成Tab.1 Composition of winery wastewater

通过预实验，采用不同稀释倍数（0 倍：100%，V/V；2 倍：50%，V/V；4 倍：25%，V/V；8 倍：12.5%，V/V）的酿酒废水培养微藻，发现微藻在未稀释废水的培养基中无生长迹象，而在其它培养条件下均能较好生长.最终确定以稀释2 倍的酿酒废水作为本实验废水培养基.

1.3 实验设计

1.3.1 实验方案

培养液以稀释2 倍后的酿酒废水培养基作为对照，在不改变总氮浓度（40.25 mg/L）及其它介质条件下，调节总磷初始浓度，分别设置0.50、5.46、16.40、49.20、147.60、442.80 mg/L 浓度梯度组单独培养莱茵衣藻、二形栅藻，并设置共培养实验组，其中总磷初始浓度为16.40 mg/L，另设置对照组，每组设3 个平行组.在温度（25±1）℃，光照强度2 000 lux，光周期12 L:12 D 下静置培养，每天调换锥形瓶位置并人工摇动至微藻均匀悬浮于培养液中，每隔一天取其培养液，测定微藻生物量（干重法）、培养液TN、TP、COD、pH 等指标.实验周期为17 d.

1.3.2 指标测定

（1）微藻生物量、比生长速率测定

把藻细胞沉淀置于80 ℃箱烘干至恒重，取出后于干燥器中自然冷却，而后称其干重.由于比生长速率可定义为单位重量细胞的瞬时增量，生理含义明确，便于实际应用，因此本文采用比生长速率作为衡量微藻细胞生长指标之一.

微藻的比生长速率为[11]

式中：μm为 比生长速率，d-1；X1、X2分别为起始取样时（t1）和结束取样时（t2）的生物量.

（2）蛋白质产量测定

本文采用改良后的微藻蛋白质提取方法[12]，并采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定上清液中的蛋白质含量，即微藻的蛋白质含量（按鲜重计）.

（3）氮、磷、有机物吸收速率、去除率和去除量测定

测定250.00 mL 实验组培养液的TN、TP 和COD，根据测出的相应含量，计算得到氮、磷和COD 的吸收速率[13]为

式中：S0、St分别为起始时和培养td 后培养液中TN 的浓度，mg/L；V为培养液体积，L；B为莱茵衣藻的干重，mg/L.

根据测出的TN、TP 和COD 含量，计算得到去除率为

式中：C0和Ct分别为最初浓度和培养td 后的浓度，mg/L.

1.4 数据处理与分析

采用origin 9.0、excel 2016 及SPSS 等统计软件对数据进行统计分析和制图.

2 结果与分析

2.1 不同TP 浓度调控对微藻生长的影响

不同TP 浓度条件下，各组微藻生长趋势如图1、2 所示.由图1可以看出，不同总磷浓度梯度条件对微藻生长的影响比较明显.单一培养的莱茵衣藻在培养初期生长迅速，而前3 d 内单一培养二形栅藻和共培养微藻的生长均较为缓慢，从第3 天开始微藻迅速生长，藻体逐渐进入对数生长期，各实验组到第13 天左右干重增速开始出现不同程度减缓.由图2看出，实验周期内，当初始TP 浓度为0.50 mg/L时，莱茵衣藻、二形栅藻和共培养微藻的 μm分别为0.230、0.254、0.262 d-1，均为实验组最低.微藻 μm均随TP 浓度升高而先逐渐上升后降低，当初始TP 浓度高于16.40 mg/L 时，总磷浓度的变化对微藻比生长速率影响不大，且在初始TP 浓度为16.40 mg/L时，二形栅藻、莱茵衣藻和共培养微藻的 μm均达到最大值，分别为0.363、0.350、0.358 d-1.

图1 生长曲线比较Fig.1 Comparison of growth curves

图2 不同磷浓度梯度下微藻比生长速率比较Fig.2 Comparison of specific growth rates of microalgae under different phosphorus concentration gradients

初始TP 浓度较低组（0.50、5.46 mg/L）的微藻在经过环境适应阶段后，从第3 天开始生长速度较其它组明显减缓，尤其是初始TP 浓度为0.50 mg/L微藻组，实验结束时，莱茵衣藻和二形栅藻的生物量分别仅为108.00 mg/L 和100.00 mg/L，而共培养微藻生物量最终达到150.00 mg/L 左右，成为本阶段实验中微藻生长最差的实验组.

初始TP 浓度为49.20、147.60 mg/L 的莱茵衣藻长势较好，从第3 天开始生长速率均大幅增大，到第11 天增速有所降低，最终生物量分别达到722.00、688.00 mg/L，如图1（a）所示；对于单一培养条件的二形栅藻而言，初始TP 浓度为49.20 mg/L实验组在前9 d 内生长低于初始TP 浓度147.60 mg/L实验组，随后前者生长高于后者，二者均于第13 天生物量达到最大，分别为550.00、475.00 mg/L，如图1（b）所示；共培养组下在初始TP浓度49.20 mg/L 时，最终生物量达到637.50 mg/L，如图1（c）所示.

初始TP 浓度为16.40 mg/L 组的莱茵衣藻长势最佳，培养第17 天时生物量达到839.50 mg/L，是本阶段实验中莱茵衣藻生长最佳的实验组；对于单一培养二形栅藻来说，当培养到第13 天时生物量达到该条件培养周期的最大值650.00 mg/L；共培养下的微藻生长曲线略高于单一培养下的二形栅藻生长曲线，实验结束时微藻生物量达到768.75 mg/L.

与低磷浓度组微藻相比，初始TP 浓度为442.80 mg/L 组的各微藻生长较好，实验结束时，单一培养莱茵衣藻、二形栅藻和共培养微藻生物量分别能达到456.50、275.00、350.00 mg/L.该实验组微藻的生长曲线高于低磷浓度组，但低于其它组，说明氮磷比过高或过低，微藻的生长会受到明显的影响，且对低磷浓度的培养条件更敏感.

从生长曲线可以看出，莱茵衣藻的干重明显高于二形栅藻；共培养下的生长曲线处于两种单一培养微藻下的生物曲线之间，说明该培养条件下两种微藻的生长可能存在协同关系.低磷浓度实验组的微藻在培养初期并未像低氮浓度实验那样过早进入平缓期，这可能是由于在初期培养基内的总氮较总磷资源丰富，微藻在生长时首先利用总氮，导致总磷对其生长的限值作用不大明显，随着微藻生长大量繁殖，对营养物质的需求较高，而培养基内营养不充分，导致部分微藻生长进入衰亡期.

2.2 不同TP 浓度调控对微藻蛋白质含量的影响

不同TP 浓度条件下，莱茵衣藻蛋白质含量的变化情况如图3所示.由图3可看出，各实验组莱茵衣藻蛋白质含量随培养时间推移而上升，而二形栅藻实验组和共培养实验组的微藻5 d 后各组蛋白质含量的增速加快，到第9 天蛋白质含量增长变缓.

图3 不同磷浓度梯度下的蛋白质含量比较Fig.3 Comparison of protein content of microalgae under different phosphorus concentration gradients

当TP 浓度在0.50～5.46 mg/L 时，随着TP 浓度的增加，藻体蛋白质含量增加；而当TP 浓度超过5.46 mg/L，藻体蛋白质含量随TP 浓度的增加而逐渐减小.TP 浓度为16.40 mg/L 时，实验组藻蛋白质含量最高，第17 天时单一培养下莱茵衣藻蛋白含量为53.37 mg/L，占其干重的6.36%；二形栅藻蛋白含量为131.04 mg/L，占其干重的20.56%.而共培养下微藻的藻蛋白处于单培养下两种藻蛋白含量之间且较低水平，这可能是由于共培养下二形栅藻生长受到抑制，而莱茵衣藻与二形栅藻相比蛋白含量明显较低，因此,共培养下所获得的藻蛋白含量比单培养下二形栅藻所获得的藻蛋白较低.

磷是微藻细胞内核酸、蛋白质和磷脂的主要成分，参与藻体生长过程中的各种代谢，对微藻生长起着重要的作用[14].实验结果发现，TP 浓度为0.50 mg/L的磷限制组蛋白质含量处于所有实验组的最低水平.其原因在于，当藻体处于低磷培养液环境中，藻体会因不能获得足够的磷营养而导致生物量少，蛋白质合成则会受到抑制.

2.3 不同TP 浓度调控微藻对氮磷及有机物去除效果的影响

实验结束时，各组微藻对TP、TN 和COD 的去除率和去除量如图4所示.

2.3.1 不同TP 浓度微藻对TP 吸收速率的影响

实验周期内，各组微藻对TP 吸收速率如图5，TP 去除率及去除量如图4（a）.

莱茵衣藻和共培养微藻对TP 的吸收速率随TP 浓度的升高呈逐渐上升趋势.当初始TP 浓度为5.46 mg/L 时，二形栅藻对TP 的吸收速率高于莱茵衣藻和共培养下的微藻，最终分别为0.039 3、0.016 8 、0.021 4 d-1.当初始TP 浓度超过147.60 mg/L 时，微藻对TP 的吸收速率出现大幅度增加，并达到最大值；初始TP 浓度为442.80 mg/L 时，三种条件下的微藻TP 吸收速率分别为0.276 9、0.096 1、0.208 8 d-1.初始TP 浓度为0.50 mg/L，总体达到了地表水环境质量标准（GB3838—2002）的Ⅲ类水总磷要求.初始TP 浓度低于5.460 mg/L 的实验组中，莱茵衣藻和共培养的微藻对TP 的去除效率几乎保持一致（90%以上），均高于同等培养条件下二形栅藻对TP 的去除效率，但无明显差异（p＞ 0.05）；随着初始TP 浓度升高，莱茵衣藻对TP 的去除优势在三种微藻种显得更加明显（p＜ 0.05）.但初始TP 浓度高于147.60 mg/L实验组的莱茵衣藻的TP 去除量较大，达到所有实验组中的最大值，初始TP 浓度为147.60、442.80 mg/L，对应的TP 去除量分别为36.14、97.23 mg/L，去除率分别为24.48%和21.96%.

图4 第17 天不同磷浓度梯度下微藻对TP、TN 和COD 的去除率和去除量Fig.4 Removal rate and removal amount of TP、TN and COD from microalgae under different phosphorus concentrations on 17th day

由式（3）可知，当微藻对TP 的吸收量一定时，微藻干重越低，单位质量的微藻对TP 吸收速率就会越高.相比其它组，由于TP 浓度为442.80 mg/L的6 个实验组微藻生长受到不同程度的抑制，出现TP 去除量高而藻体生物量低的情况，致使该实验组微藻的TP 吸收速率会比其它组明显增大.

图5 不同磷浓度梯度下微藻对TP 吸收速率比较Fig.5 Comparison of TP uptake rate of microalgae under different phosphorus concentration gradients

综合比较各实验组中微藻对TP 吸收速率、去除率和去除量，可知初始TP 浓度为16.40 mg/L 左右的培养基环境中微藻对TP 去除效果最优，莱茵衣藻、二形栅藻和共培养微藻对TP 的去除率分别达到91.75%、73.93%和83.66%.

2.3.2 不同TP 浓度微藻对TN 去除速率的影响

实验周期内，各实验组培养液中TN 浓度变化情况如图6，实验结束时TN 去除量和去除率如图4（b）.对莱茵衣藻而言，当初始TP 浓度高于5.46 mg/L 时，实验周期内对TN 去除效果较好，均达到80%以上，尤其当初始TP 浓度为16.40 mg/L时，此时培养基初始时的氮磷比为2.45，最终对TN去除量达37.63 mg/L，去除率达93.48%；当初始TP 浓度为0.50 mg/L 时，藻体对TN 去除率最终只有47.62%.此外，莱茵衣藻对TN 去除效率略低于二形栅藻，当初始TP 浓度为16.40 mg/L 时，二形栅藻和共培养微藻对TN 去除率分别高达95.76%和95.24%，达到了地表水环境质量标准（GB3838—2002）的Ⅳ类水总氮要求.整个实验阶段，共培养下微藻对TN 的去除效果与二形栅藻保持较一致的水平，这也说明在共培养条件下二形栅藻对废水的资源化利用起主导作用，并可能对莱茵衣藻吸收TN起到一定程度的抑制.

由图6可知，初始TP 浓度为0.5 mg/L 时，莱茵衣藻实验组在培养初期出现TN 浓度升高的现象，这可能是由于微藻细胞在最初为适应高氮磷比的培养环境向外释放出硝酸盐所致.此外，TN 浓度在培养中期均呈现小幅度上升再下降的趋势，这可能是由于在微藻进入生长平缓期后，部分微藻死亡会重新释放一定量的氮，作为营养源再次被微藻重复利用于生长.

图6 不同磷浓度梯度下TN 浓度变化比较Fig.6 Comparison of TN concentration in culture medium under different phosphorus concentration gradients

2.3.3 不同TP 浓度下微藻对有机物去除速率的影响

初始TP 浓度为0.50、5.46 mg/L 的培养基中，初始COD 浓度分别为57.00、622.50 mg/L，其余实验组培养基中，初始COD 浓度为1 867.50 mg/L.实验周期内，各实验组培养液中有机物浓度变化情况如图7，实验结束时COD 去除量和去除率如图4（c）.实验结果显示，随着藻体的生长，培养基中COD 明显降低，莱茵衣藻实验组在培养结束时达到最低，6 组实验培养基中COD 浓度最终分别为14.50、259.50、599.50、562.00、554.50、599.50 mg/L，COD 去除率最大分别达到74.56%、58.31%、67.90%、69.90%、70.31%、67.90%.二形栅藻对COD 去除效果整体上略高于莱茵衣藻，但差异并不显著（p＞ 0.05）.而二形栅藻实验组COD 浓度在实验初期随着微藻的生长呈明显降低趋势，在实验结束时达到最小值，分别为27.00、99.50、309.50、274.50、312.00、429.50 mg/L，COD 最大去除率分别达52.63%、84.02%、83.43%、85.30%、83.29%、77.00%；共培养微藻对培养基内COD 去除规律与二形栅藻类似：实验结束时COD 浓度达到最小值，分别为12.00、104.50、297.00、309.50、299.50、357.00 mg/L，COD 最大去除率分别达78.95%、83.21%、84.10%、83.43%、83.96%、80.88%.

图7 不同磷浓度梯度下COD 浓度变化比较Fig.7 Comparison of COD concentration in culture medium under different phosphorus concentrations

二形栅藻在初始总磷浓度为0.50 mg/L 时，COD去除效果最差，这可能是由于过高的氮磷比不利于二形栅藻生长，导致藻体自身分泌一些有机物，此时共培养微藻与莱茵衣藻对COD 的去除效果呈现一致性，这也可能说明了高氮磷比培养条件下，莱茵衣藻比二形栅藻更具有耐受性，更具有废水净化的能力.

3 结 论

（1）莱茵衣藻对磷的需求总体上大于二形栅藻对磷的需求，当初始总磷浓度为16.40 mg/L，初始氮磷比为2.45 时，莱茵衣藻最终生物量达到839.50 mg/L，藻蛋白含量达到53.37 mg/L，对TN、TP、COD 的最终去除率分别达到93.48%、91.75%、67.90%.

（2）当初始总磷浓度为16.40 mg/L 时，初始氮磷比为2.45，二形栅藻生物量最高达到650.00 mg/L，藻蛋白含量达到131.04 mg/L，对TN、TP、COD 的最终去除率分别达到95.76%、73.93%、83.43%.

（3）两种藻在共培养条件下，生长曲线处于单一培养微藻下的生物曲线之间，共培养微藻的藻蛋白含量处于两种单培养下藻蛋白含量之间，且处较低水平，对TP、TN 的去除率分别为83.66%、95.24%，共培养条件下微藻对酿酒废水COD 的去除规律与二形栅藻单一培养条件类似.

（4）采用酿酒废水-微藻培育耦合体系，无论是单一还是共培养体系，酿酒废水总体均能达到地表水环境质量标准（GB3838—2002）的Ⅳ类水总磷要求.

致谢：成都市科技局科技项目（2015-HM01-00013-SF）.