小麦麸皮酸解液脱毒发酵制备苹果酸的可行性

郭娜 谢宾 刘兴运

摘要 [目的]研究小麦麸皮酸解液中糠醛和5-羟甲基糠醛经活性炭吸附脱除处理及脱除后进行发酵制备苹果酸的可行性。[方法]通过添加不同浓度的糠醛、5-羟甲基糠醛，研究其对曲霉发酵生产苹果酸的影响;采用活性炭吸附方法，研究其对小麦麸皮酸解液中糠醛、5-羟甲基糠醛的脱除效果，并对脱毒后小麦麸皮酸解液进行曲霉发酵生产苹果酸。[结果]使用活性炭对小麦麸皮酸解液进行脱毒处理，最适条件为活性炭含量1.5%、处理温度30 ℃、时间40 min;在此条件下，小麦麸皮酸解液中的糠醛与5-羟甲基糠醛的脱除率分别达63.87%和61.49%。脱毒后的小麦麸皮酸解液可以作为发酵生产苹果酸的碳源，含有的糠醛与5-羟甲基糠醛含量显著减少。[结论]经活性炭处理后的小麦麸皮酸解液作为碳源进行发酵生产苹果酸是可行的。

关键词 小麦麸皮;酸解液;脱毒;活性炭;糠醛;5-羟甲基糠醛;苹果酸

中图分类号 TS210.9文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）11-0169-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.048

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to study the feasibility of fermentation of furfural and 5HMF in wheat bran acid hydrolysate by adsorption and removal of activated carbon to prepare malic acid.[Method]The effects of fermentation on the production of malic acid by Aspergillus were studied by adding different concentrations of furfural and 5HMF.The activated carbon adsorption method was used to study the removal effect of furfural and 5HMF in wheat bran acid hydrolysate， and the malic acid fermentation of wheat bran acid hydrolysate was carried out to produce malic acid.[Result]The activated carbon was used to detoxify wheat bran acid hydrolysate.The optimum conditions were 1.5% activated carbon content， 30 °C treatment temperature and 40 min time. Under these conditions， the removal rates of furfural and 5hydroxymethylfurfural in wheat bran acid hydrolysate were 63.87% and 61.49%， respectively.The detoxified wheat bran acid hydrolysate could be used as a carbon source for the production of malic acid by fermentation， and the content of furfural and 5hydroxymethylfurfural was significantly reduced.

Key words Wheat bran;Acidolysis solution;Detoxification;Activated carbon;Furfural;5HMF;Malic acid

基金项目 合肥师范学院人才科研启动基金项目（2014rcjj06）。

作者简介 郭娜（1984—），女，安徽蚌埠人，讲师，博士，从事食品科学研究。

收稿日期 2018-11-08

L-苹果酸是一种天然有机酸，因其口感与苹果酸味接近，是一种优良的酸味剂，被广泛应用于高档饮料与食品行业;其在医药上有着重要的作用，用于治疗肝功能不全、肝衰竭和贫血等疾病[1-2]。目前依靠粮食作为原料发酵生产苹果酸，随着市场对其需求量的日益增大，采用非粮资源生产苹果酸成为一种势在必行的可行途径。小麦麸皮是面粉副产物，富含纤维素、半纤维素等成分，在高温条件下进行酸解，可降解生成葡萄糖、木糖等碳水化合物，且酸解糖化率比较理想[3-4]，降解生成的碳水化合物可作为发酵生产L-苹果酸的原料，是一条增加苹果酸的生产原料、降低生产成本的可持续发展途径。

研究表明，纤维素稀酸水解产物含有的呋喃衍生物、酚类，如糠醛、5-羧甲基糠醛（5-HMF）是后期发酵菌种生长和发酵的主要抑制物，必须经过处理才能利用[5-6]。Cavka等[7]利用硼氢化钠在20 ℃和pH 6.0的条件下处理云杉木质纤维水解物，有效地降低了抑制物（对苯醌、2，6-二甲氧基苯醌和糠醛等）的含量，使生物乙醇的产率从0.02 g/g提高至0.30 g/g。Chen等[8]通过真空旋转蒸发法脱毒，脱毒效果良好，其中可挥发性呋喃的脱除率达98%。Lee等[9]通过电化学聚合方法去除木质纤维素中的酚類化合物，有效地脱除了稻草水解产物中的酚类物质，达到降低抑制作用的效果。李志强等[10]利用石墨化碳对竹材稀酸预处理液中的发酵抑制物进行脱除效果研究，结果表明石墨化碳能够有效脱除发酵抑制物，脱除率达99%，脱毒后的预处理液可用于乙醇发酵。

笔者通过添加不同浓度的糖醛、5-羟甲基糠醛，研究其对曲霉发酵生产苹果酸的影响;采用活性炭吸附方法，研究其对小麦麸皮酸解液中糠醛、5-羟甲基糠醛的脱除效果，并对脱毒后小麦麸皮酸解液进行曲霉发酵生产苹果酸，探究小麦麸皮酸解液作为碳源发酵生产苹果酸的可行性。

1 材料与方法

1.1 试材

小麦麸皮（合肥市场购买）;寄生曲霉（CICC40365）;5-羟甲基糠醛、糠醛等试剂均为分析纯。

1.2 设备

气浴恒稳振荡器722S，上海精密科学仪器有限公司;紫外分光光度计UV762，上海精密科学仪器有限公司;电子分析天平FA1604，上海衡平仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 小麦麸皮酸解液的制备。

小麦麸皮经粉碎并过60目筛后，于50 ℃烘箱烘干后室温密闭保存。对上述处理后的小麦麸皮进行酸解：硫酸浓度为1.5%，小麦麸皮67 g/L，100 ℃下酸解3 h。取出并自然降温后过滤，滤液经NaOH调节至pH中性，即为酸解液，用于后续试验。

1.3.2 糠醛、5-羟甲基糠醛含量的测定[11]。

准确称取1000 g糠醛和1.000 g 5-羟甲基糠醛，分别用95%乙醇溶解并稀释至不同浓度梯度。采用紫外分光光度计分别在276和284 nm处测定糠醛和5-羟甲基糠醛吸光度（OD276和OD284），建立标准曲线回归方程。结果表明，糠醛浓度在0.10～10.00 mg/L、5-羟甲基糠醛浓度在1.00～18.00 mg/L与吸光度具有良好的线性关系，线性方程分别为

Y1=0.189 9X1-0016 3（R2=0.996 6）、Y2=0.123 6X2+0.024 9（R2=0.996 9），其中Y1、Y2為吸光度，X1、X2分别为糠醛、5-羟甲基糠醛的浓度。

制备得到的小麦麸皮酸解液在3 000 r/min下离心10 min，取上清液分别稀释后采用分光光度法测定OD276和OD284，根据糠醛和5-羟甲基糠醛的标准回归方程计算出含量。

1.3.3 苹果酸含量的测定。苹果酸的检测利用的是Goodban法[12]。准确称取苹果酸标准样品溶解并稀释至不同浓度梯度，依次加入6.00 mL浓硫酸、0.10 mL 2，7-萘二酚溶液，于100 ℃的沸水中水浴20 min。反应结束后取出反应液并冷却到室温，采用分光光度法测定390 nm处吸光度，建立苹果酸标准回归曲线方程。

结果表明苹果酸浓度在10.00～80.00 mg/L与吸光度具有良好的线性关系，线性方程为

Y3=0.009 2X3+0.030 7（R2=0.997 9），其中Y3为吸光度，X3为苹果酸浓度。

取样品溶液1.00 mL（苹果酸浓度控制在10.00～80.00 mg/L）依照上述方法测定OD390处吸光度，根据线性方程计算苹果酸含量。

1.3.4 曲霉发酵产苹果酸的培养基。

曲霉发酵培养基：糖浓度100.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.1 g、KH2PO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.5 g、（NH4）2SO4 2.0 g、CaCO3 70.0 g（单独灭菌）。121 ℃下灭菌处理20 min。接种寄生曲霉，发酵培养120 h。

1.3.5 糠醛与5-羟甲基糠醛对发酵生产苹果酸的影响。

在以葡萄糖为碳源的寄生曲霉发酵生产苹果酸的培养基中分别添加不同浓度的糠醛和5-羟甲基糠醛（表1），于恒温摇床中以200 r/min、30 ℃条件下发酵培养120 h。发酵结束后测定发酵液中苹果酸含量。

1.3.6 活性炭对小麦麸皮酸解液的脱毒效果影响。

取酸解液100 mL，通过分别添加不同质量活性炭（m/V）、处理温度和处理时间，研究活性炭添加量、处理温度和时间对酸解液中糠醛、5-羟基糠醛的脱除效果。

脱除率=（脱除后的质量/脱除前的质量）×100%。

1.3.7 小麦麸皮酸解液发酵生产苹果酸的可行性。

分别以葡萄糖、小麦麸皮酸解液和脱毒后的小麦麸皮酸解液为碳源，制备相同发酵培养基（发酵液中糖含量保持相同），在200 r/min 30 ℃发酵120 h，发酵结束后检测苹果酸含量。

2 结果与分析

2.1 小麦麸皮酸解液糠醛和5-羟甲基糠醛的含量测定

分别测定糠醛和5-羟甲基糠醛的吸光度后，带入其线性方程，计算得到小麦麸皮酸解液中糠醛的浓度为（481.11±34.23）mg/L、5-羟甲基糠醛的浓度为（573.37±23.42）mg/L。这2种物质的浓度均低于文献记载的采用高压反应釜进行稀酸酸解后的最大值[13]，可能是该试验使用的硫酸浓度较低和酸解温度较低，产生的糠醛和5-羟甲基糠醛浓度也较低。

2.2 糠醛与5-羟甲基糠醛对曲霉发酵生产苹果酸的影响

从图1可以看出，糠醛和5-羟甲基糠醛含量对寄生曲霉发酵生产苹果酸有明显的抑制作用。抑制物添加量100 mg/L时，苹果酸产量明显降低，随着发酵液中糠醛和5-羟甲基糠醛含量的增加，苹果酸产量继续降低，说明发酵液中糠醛和5-羟甲基糠醛含量越高，抑制作用越明显，苹果酸发酵产酸率越低。同时也可以看出糠醛对寄生曲霉发酵产生苹果酸的抑制作用比5-羟甲基糠醛的抑制作用强烈。

2.3 小麦麸皮酸解液的脱毒条件优化

2.3.1 活性炭添加量对酸解液脱毒效果的影响。

在小麦麸皮酸解液中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（m/V）活性炭，在25 ℃下搅拌30 min，分析活性炭添加量对小麦麸皮酸解液脱除效果的影响，结果见图2。

活性炭的比表面积和微孔容积高，容易吸附小分子量有机物，是一种常用的吸附脱除方法。由图2可知，添加活性炭后，酸解液中的糠醛与5-羟甲基糠醛脱除率迅速增大，说明活性炭的添加量对糠醛与5-羟甲基糠醛脱除影响显著，也表明活性炭对糠醛与5-羟甲基糠醛具有较好的吸附能力。当活性炭含量超过1.0%时，糠醛的脱除率上升缓慢，最大脱除率为57.47%，5-羟甲基糠醛的曲线无明显变化，最大脱除率为54.70%。活性炭添加量增大可以提高酸解液中抑制物的脱除率，但总糖含量损失较大[14]，因此该试验选定活性炭浓度1.5%为最佳添加量。

2.3.2 处理时间对酸解液脱毒效果的影响。

小麦麸皮酸解液中活性炭添加量为1.5%（m/V），在25 ℃下搅拌10、20、30、40、50、60 min，分析活性炭不同处理时间对小麦麸皮酸解液脱除效果的影响，结果见图3。

从图3可以看出，处理时间对活性炭脱除糠醛、5-羟甲基糠醛的脱除效果有明显影响。在10 min内，活性炭对糠醛和5-羟甲基糠醛的脱除率迅速上升，并随着时间的延长而继续提高;超过40 min后，脱除率增加不明显，说明此时的活性炭吸附能力已饱和。活性炭对糠醛的脱除率略高于5-羟甲基糠醛，可能是5-羟甲基糠醛的疏水性比糠醛弱，影响了脱除效果，使得与活性炭的吸附力比糠醛与活性炭的吸附力弱[14-15]。

2.3.3 温度对酸解液脱毒效果的影响。

向小麦麸皮酸解液中添加活性炭含量1.5%，分别在20、30、40、50和60 ℃下搅拌40 min，分析不同温度条件对小麦麸皮酸解液脱除效果的影响，结果见图4。

由图4可知，处理温度对糠醛、5-甲基糠醛的脱除率趋势基本相同，影响也比较明显。在20～30 ℃时，脱除率明显上升，超过40 ℃后，脱除率呈下降趋势，可能是较高的温度破坏了活性炭与糠醛等物质的吸附作用力，降低了活性炭的吸附性质。

根据上述结果可知，小麦麸皮酸解液的脱毒最佳条件为活性炭添加量1.5%（m/V）、处理温度30 ℃、处理时间40 min。在此条件下进行脱毒处理后，检测得到糠醛含量173.93 mg/L，脱除率为63.87%;5-羟甲基糠醛含量为220.8 mg/L，脱除率达61.49%。

2.4 脱毒后小麦麸皮酸解液发酵生产苹果酸的可行性

研究曲霉发酵生产苹果酸耐受性发现，当糠醛和5-羟甲基糠醛含量低于200 mg/mL时，曲霉仍能进行发酵。分别以葡萄糖、小麦麸皮酸解液和最佳条件下脱毒后的小麦麸皮酸解液为碳源，发酵生产苹果酸，分析小麦麸皮酸解液脱毒处理后发酵产苹果酸的可行性，结果见图5。

47卷11期郭 娜等 小麦麸皮酸解液脱毒发酵制备苹果酸的可行性

由图5可知，以葡萄糖、小麦麸皮酸解液和脱毒后的小麦麸皮酸解液为碳源发酵制备苹果酸的产酸量分别是2543、8.32、15.56 g/L。小麦麸皮酸解液脱毒后发酵产苹果酸的量相对于未脱毒前的产酸量明显增高，说明小麦麸皮酸解液经活性炭吸附脱毒后可以用于发酵产苹果酸。

3 结论与讨论

糠醛与5-羟甲基糠醛对寄生曲霉发酵生产苹果酸有明显的抑制作用，糠醛与5-羟甲基糠醛的含量越高，对苹果酸发酵的抑制作用越显著。使用活性炭对小麦麸皮酸解液进行脱毒处理，最适条件为活性炭含量1.5%、处理温度30 ℃、时间40 min;在此条件下，小麦麸皮酸解液中的糠醛与5-羟甲基糠醛的脱除率分别达63.87%和61.49%。酸解液中糠醛与5-羟甲基糠醛含量下降至200 mg/L左右，显著降低了这2种抑制物对小麦麸皮酸解液发酵生产苹果酸的抑制作用。经活性炭处理后的小麦麸皮酸解液作为碳源进行发酵生产苹果酸是可行的。

随着市场对L-苹果酸的需求量日益增大，采用非粮资源如小麦麸皮和玉米秸秆等，通过糖化和脱毒处理降低抑制物含量，基因技术选育纤维素水解物耐受性菌株进行发酵生产L-苹果酸是一条经济可行和可持续发展的途径[16]。

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