苔干酶促褐变归因分析

燕傲蕾,肖清臣,周 奎,王玉民

(亳州学院,安徽亳州 236800)

苔干(LactucaSativaVar.angustata)又名贡菜、响菜、山蛰菜,属菊科(Compositae)莴苣属(Lactuca)植物[1]。苔干口感爽脆、营养丰富,有健胃、利水、降压、软化血管等多种功效,被誉为“天然保健品、植物营养素”[2-3]。作为安徽省涡阳县的地理标志产品,苔干通过了美国和欧盟有机食品认证,受到国内以及日韩、欧美、港澳台等十几个国家和地区人民的喜爱,是安徽省重点出口的绿色有机农产品之一[4],在全民养生时代创造了很高的经济价值。在苔干国标(GB/T 29564-2013)中,色泽是苔干分级的重要评价指标。但是,苔干在天然晾制脱水环节中,需要晴朗微风天气,若天气不佳未能及时脱水,就会褐化变黑、发霉甚至腐败变质。此外,苔干在储存过程中也存在褐变情况,影响了苔干的分级和商业价值。分析苔干褐化现象的成因并对其进行控制,对苔干产业意义重大。

褐变分为酶促褐变和非酶促褐变两种[5],目前,国内外学者多数认为酶促褐变是果蔬褐变的主要类型[6-8]。根据酚-酚酶分布学说[9],完整植物细胞中酚类物质和酚酶储存在不同分区,在植物受到切割伤害后,底物和酶在细胞内的储存分区被破坏,在有氧条件下,酚类氧化成醌,醌经过自发聚合并与蛋白质的氨基酸残基侧链基团反应形成黑褐色物质,导致酶促褐变的发生[10-11],可见酶促褐变需要底物、酶和活性氧三个条件。其中,酚类物质是酶促褐变的关键底物[12-13];多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO;EC 1.14.18.1)是大多数果蔬酶促反应的关键酶[14-16],也是现在果蔬酶促褐变研究的重点,目前,PPO在酶学特性和褐变机制方面已进行了大量研究,PPO基因在梨[17]、莲藕[18]、石榴[19]、龙眼[20]等多种植物中被相继克隆;过氧化物酶(Peroxidase,POD;EC 1.11.1.7)常与PPO存在协同作用[13],能将酚类物质和类黄酮氧化聚合形成褐色物质引起褐变[21-22],也是部分果蔬褐变的主要因素[23-24]。截至目前,苔干PPO纯化后的酶学特性和苔干PPO活性控制的工艺条件已有所研究[25-26],但研究对象局限于PPO上,对苔干在不同时间段、不同部位的褐变情况及其主要影响因素的研究十分匮乏。

本文以“涡青一号”苔干为实验材料,通过研究苔干在去皮加工后不同时间、不同部位褐变度，褐变底物(酚类)含量变化，褐变相关酶PPO、POD活性变化，并分析酶活性、酚类含量与褐变度的相关性,明确苔干不同时间、不同部位的褐变机理及其差异,为苔干的脱水加工和褐变控制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苔干 于18年5月上旬,在安徽省义门镇苔干种植基地挖取主茎顶端最高叶片的叶尖相平齐的 “涡青一号”苔干[27],根部带土装入采样袋,2 h内乘车带回实验室,栽在花盆中备用;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、过氧化氢(30%)、无水乙醇 AR，国药集团化学试剂有限公司;邻苯二酚 CP，国药集团化学试剂有限公司;愈创木酚 美国Sigma公司;交联聚乙烯基吡咯烷酮(Crosslinked polyvinylpyrrolidone,PVPP)、福林酚 合肥博美试剂有限公司。

FA2004N电子天平 上海菁海仪器有限公司;FS-1(YQ-3)电动组织匀浆机 常州金坛友联仪器研究所;KQ-250B超声波清洗机 昆山超声仪器有限公司;UV-6000T紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;H1850R高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;Infinite M1000 Pro酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 按照从苔干去皮到取样的间隔时间,设置0、4、8、20、30、48 h 6个实验组,每组3根苔干,在实验室内按照去苔叶、打苔脑、刨苔皮、剖苔条、脱水的传统手工作业方式[28]对“涡青一号”进行处理,并在室内窗户边悬挂自然脱水。实验进行期间天气多云,温度14～27 ℃。对上述6个实验组进行取样测定,将去皮后的苔子距末梢嫩叶3 cm部分定为苔头,距根部5 cm部分定为苔根,苔头和苔根中间的部分为苔茎,实验材料切碎后按“四分法”缩分至10 g左右备用[29]。

1.2.2 褐变度测定 以谭谊谈等[30]的方案为基础并进行调整。准确称取3.0 g植物材料,加10 mL 4 ℃预冷的蒸馏水研磨打碎,再用5 mL 4 ℃预冷的蒸馏水冲洗研钵,4 ℃ 10000 r/min离心15 min。取上清液,以蒸馏水为空白对照,在410 nm下测定其吸光度,以410 nm处的吸光值表示褐变度。

褐变平均增速(%/h)=[(An-An-1)/(An-1(ΔT)]×100

式中:An为某一时间点的褐变度;An-1为前一时间点的褐变度;ΔT为两个时间点的时间差,h。

1.2.3 总酚含量测定 总酚含量测定采用福林酚法[31]。准确称取1.0 g植物材料,加10 mL 60%乙醇打碎,再用10 mL 60%乙醇冲洗,转移到50 mL三角瓶中,在60 ℃、250 W下超声提取40 min后过滤,再用60%乙醇定容到25 mL。取定容后的总酚提取液1 mL至试管中,依次加入蒸馏水5 mL、福林酚 1 mL,混匀后静置5 min,再加 0.5 mol/L的Na2CO34 mL,室温下避光反应60 min,定容到25 mL。在750 nm波长下以蒸馏水为空白对照测其OD值,以吸光值代表总酚含量。

总酚平均增速(%/h)=[(An-An-1)/(An-1(ΔT)]×100

式中:An为某一时间点的总酚含量;An-1为前一时间点的总酚含量;ΔT为两个时间点的时间差,h。

1.2.4 PPO、POD酶活性测定

1.2.4.1 PPO、POD粗酶液提取 酶液提取参考冯立娟等[32]的方法并进行调整,准确称取3.0 g植物材料,加4 ℃预冷的0.05 mol/L pH7.0的PBS 9 mL、PVPP 0.1 g,用匀浆机或研钵打碎植物材料,4 ℃ 10000 r/min离心15 min,上清液即为POD和PPO粗酶液,4 ℃储存备用。

1.2.4.2 PPO活性测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法[31]。在预实验中利用紫外-可见分光光度计和酶标仪对苔干酶粗提液中PPO的检测波长、时长、pH、温度、加酶量和底物浓度进行了梯度设置和筛选,最终确定实验方案如下:取PPO酶粗提液0.3 mL,加2 mL pH7.2的 PBS和1 mL 0.05 mol/L的邻苯二酚,室温下混合后立即在410 nm 波长下测其OD值变化情况,每隔20 s测定一次,共测定1 min。以每分钟内吸光值变化0.01定义为1 U。

PPO活性平均增速(%/h)=[(An-An-1)/(An-1(ΔT)]×100

式中:An为某一时间点的PPO活性;An-1为前一时间点的PPO活性;ΔT为两个时间点的时间差,h。

1.2.4.3 POD活性测定 配制POD反应液:每50 mL 0.05 mol/L pH7.0的PBS加愈创木酚28 μL,60 ℃加热搅拌至愈创木酚完全溶解,冷却后加入30%的H2O2溶液19 μL,混匀,4 ℃保存备用。

POD活性测定采用愈创木酚法[33]。经预实验筛选,最终确定实验方案如下:取POD酶粗提液0.3 mL,加pH7.0的POD反应液3 mL,室温混合后立即在470 nm 波长下测其OD值变化情况,每隔30 s测定一次,共测定2 min。以每分钟内吸光值变化0.01定义为1 U。

POD活性平均增速的计算同PPO。

1.3 数据处理

每组实验设三个重复,实验所得数据使用Excel 2007计算平均值、标准偏差并用Origin 8.0制图,用SPSS 17.0进行数据差异显著性分析(p<0.05代表有显著差异;p<0.01代表有极显著差异)和相关性分析(*表示显著相关,p<0.05;**表示极显著相关,p<0.01)。

2 结果与分析

2.1 苔干不同部位褐变度的变化

从图1可以看出,苔干去皮后苔头、苔茎和苔根的褐变度均随时间增加而上升。其中去皮8 h内苔头、苔茎和苔根的褐变程度维持在较低的水平;在8～30 h苔茎和苔根的褐变度均显著提高,在8、20、30 h均存在显著差异(p<0.05);在20～30 h苔头褐变度显著提高(p<0.05),30～48 h时间段,苔头的褐变度仍显著增高(p<0.05),增幅高达73.10%,苔茎和苔根的褐变度则趋于稳定,分别升高7.40%和2.37%。30 h后苔头的褐变度明显高于苔茎和苔根,可能与苔头较细,创伤部位相对较大有关。从不同时间段苔干各部位褐变的平均增速可以看出(表1):去皮初期苔头、苔茎、苔根分别在0～4、0～8、4～8 h内表现出较高的褐变增速,但在8～20 h阶段,苔头、苔茎和苔根的褐变增速均达到最高水平,之后随着时间的增加不断下降,8～20 h是苔干整体褐变控制的关键时间段。

图1 苔干各部位褐变情况

表1 苔干各部位在各时间段褐变度的平均增速

2.2 苔干不同部位总酚含量的变化

酚类物质在果蔬生长发育过程中合成,在果蔬中含量较为丰富,其种类和含量对褐变影响重大[34-35],机械伤害等逆境胁迫也能刺激酚类的合成[36]。从图2可以看出,随着时间的增加,苔干各部位的总酚含量均表现出先上升后下降的趋势,且在20 h处达到最大值。其中,在0～8 h时,苔茎总酚含量上升最快(表2),在0、4、8 h时均存在显著差异(p<0.05),苔干各部位的总酚含量增速表现为苔茎>苔头>苔根;在8～20 h时,苔干各部位总酚含量均显著升高(p<0.05),其中,苔头的总酚含量上升最快,增速表现为苔头>苔茎>苔根;20 h后,苔头、苔茎、苔根中总酚含量均有所下降,其中,苔头和苔根的总酚含量下降较明显,在30 h时的总酚含量与20 h时存在显著差别(p<0.05),苔头的下降幅度则较小,在30、48 h时的总酚含量与20 h时无显著差异(p>0.05)。可见苔干去皮后,储存在细胞中的酚类被释放,导致苔干各部位总酚含量快速上升。同时,在有氧和酶的条件下,酚类底物被氧化成醌类,导致后期苔干各部位中总酚含量的下降。

图2 苔干各部位总酚含量

表2 苔干各部位在各时间段的总酚含量平均增速

2.3 苔干不同部位褐变相关酶活性的变化

2.3.1 苔干不同部位PPO酶活性的变化 PPO是植物体内广泛存在的一种含铜氧化酶。众多研究证实PPO是大多数果蔬酶促褐变的关键酶,鸭梨[37]、紫薯[38]等多种果蔬的褐变程度均与PPO活性正相关。从图3可以看出,苔干各部位PPO的活性均随着时间的增加而上升。去皮8 h内,苔头、苔茎和苔根的PPO活性变化不大。8 h后,苔头、苔茎和苔根的PPO活性均显著上升,在8、20、30、48 h之间均存在显著差异(p<0.05),其中,苔头PPO活性增长最快,苔茎次之,苔根最低。从苔干各部位PPO活性增速上来看(表3):4 h后,苔头、苔茎和苔根的PPO活性增速不断上升,在8～20 h时间段达到峰值;20 h后,苔头、苔茎和苔根的PPO活性平均增速均有所降低,但在8 h后,PPO活性平均增速均表现为苔头>苔茎>苔根。

图3 苔干各部位PPO活性

表3 苔干各部位在各时间段的PPO活性平均增速

2.3.2 苔干不同部位POD酶活性的变化 POD是一种广泛存在于真核生物细胞中的铁卟啉金属有机催化剂,与PPO同时存在时,能提高彼此活性,表现出协同作用。在西瓜汁[39]、百合[40]的褐化研究中,POD是其褐变的主要影响因素。在酶学性质方面,POD耐热性较好,在大多数果蔬中活性较强,因此常做为高温灭酶过程中衡量热处理效果的指标,也是目前酶促褐变研究的重点。从图4可以看出,苔干各部位POD的活性同样随时间增加而上升,但在20 h内,苔头、苔茎和苔根的POD活性变化不大;20 h后,苔头、苔茎和苔根的POD活性显著上升,在20、30、48 h时POD活性均存在显著差异(p<0.05)。从苔干各部位POD活性增速(表4)可以看出:20～30 h是苔干各部位POD活性增长最快的时期,整体上显著高于其它时段(p<0.05),且增长速度为苔头>苔茎>苔根。

图4 苔干各部位POD活性

表4 苔干各部位在各时间段的POD活性平均增速

2.4 苔干不同部位褐变度与总酚和酶活性的相关性分析

苔干不同部位(苔头、苔茎和苔根)以及各时间节点苔干的褐变度与总酚含量、PPO活性和POD活性的相关分析结果见表5、表6。从表5可以看出:在苔干各部位的褐变过程中,PPO、POD活性与苔头、苔茎和苔根褐变度均极显著相关(p<0.05),可见与酚类底物相比,PPO、POD活性对苔干褐变影响更大。

表5 苔干各部位褐变度与总酚、PPO活性和POD活性的相关性分析

从表6可以看出:苔干在去皮4 h内,褐变度与总酚含量显著相关(p<0.05);在4～20 h中,影响苔干褐变度的因素较为复杂,总酚含量、PPO活性均未与褐变度存在显著相关性(p>0.05);30 h时,苔干褐变度与总酚含量PPO、POD活性均显著相关(p<0.05),30 h后,总酚含量、PPO、POD活性均与苔干褐变度极显著相关(p<0.01)。造成这种现象的原因可能是:酚类物质在正常情况下储存在液泡里,机械损害导致酚类的释放,影响早期褐变程度。随着时间的推移,酚类物质不断在酶的作用下转化形成醌类,醌类进行非酶反应,进一步氧化聚合形成黑褐色的物质,导致总酚含量下降,底物总酚也逐渐成为苔干进一步褐化的限制因素。

表6 各时间点苔干褐变度与总酚、PPO活性和POD活性的相关性分析

3 结论与讨论

苔头、苔茎和苔根在苔干去皮前期的褐化情况相差不大,但30 h后,与苔茎和苔根相比,苔头中总酚含量较高，PPO、POD活性增速更高,使苔头褐化度大幅度高于苔茎和苔根。因此在苔干褐变控制中,要特别注意苔头的褐变控制,以免影响苔干的品相和质量。PPO、POD活性与苔干各部位的褐变度均极显著相关(p<0.01),尤其是苔干加工后期,PPO、POD活性与苔干褐变度极显著相关(p<0.01),体现出PPO、POD活性在苔干酶促褐变中的重要影响。同时,PPO、POD活性的提升情况具有差异性,PPO和POD活性增速最快的时间段分别在8～20 h和20～30 h,因此在对苔干进行灭酶处理时,应尽量在去皮8 h内对PPO进行灭活,降低PPO活性和PPO、POD酶的协同作用,以达到减轻苔干褐变的目的;而温度耐受性较高的POD,其灭活时间可适当放宽,在苔干去皮20 h内进行即可。苔干中的PPO、POD酶可分温度、分时间段进行控制,以达到更好的褐变控制效果。