白扁豆提取物对幽门螺杆菌损伤人胃黏膜上皮细胞的修复作用

任娇艳，高立，苟娜，李良，袁尔东，*，杨宜婷，*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510641；2.无限极（中国）有限公司，广东广州510665；3.中新国际联合研究院，广东广州510000）

据流行病学调查统计，世界范围内人群中幽门螺杆菌感染率在50%以上，发展中国家的感染率达到80%～90%[1]。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种微需氧的革兰氏阴性细菌，呈螺旋状，能产生有毒性作用的脲酶以中和胃酸，便于其在低pH 环境的胃部定殖[3]。由于人类免疫反应无法有效对抗Hp 这种细菌，它一旦在胃中定殖，便会一直存在于宿主中，其分泌的毒蛋白能破坏胃黏膜上皮细胞的屏障功能，对胃黏膜造成渐进性损伤[4-5]，甚至会引发十二指肠溃疡、胃溃疡、胃腺癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等许多疾病[6-7]。据统计，10%～20%的Hp 感染者会患上消化性溃疡，且约有1%的感染者会发展为胃癌，几率是正常人的 2 倍～7 倍[8-9]。

研究显示，根除Hp 可显著改善胃黏膜萎缩，从而预防胃癌的发生[10]。传统的治疗方法是三联疗法，即质子泵抑制剂辅加两种抗生素[11]。但是，随着抗菌药物的广泛使用，抗菌药物耐药性一直在增加，传统三联疗法的治愈率也在不断降低[12]。因此，迫切需要研究出新型根除Hp 的有效方法，以缓解由Hp 感染引发的胃部损伤。

从天然植物中寻找安全、高效的活性成分，是现代食品、功能性食品和医药领域的研究热点。我国传统的中草药资源是天然活性成分的巨大宝库，亟待更深入的研究与开发。中草药在治疗Hp 感染引起的胃黏膜损伤已显示出良好疗效且副作用小，从中药中提取活性成分来加以应用具有很大潜力[13-14]。目前，多数研究所用原料为药用植物[15-17]，而本研究对象选自药食同源原料，不仅可应用于中药配伍，亦可作为食品基料应用于食品研发。

针对这种不足，本论文在研究各种不同药食同源的中药提取物对人胃黏膜上皮细胞（human gastric epithelial cell line，GES-1）影响的基础上，筛选出具有良好促进GES-1 细胞增殖作用的白扁豆提取物，进一步分析其对Hp 的抑制作用及抑菌机理，探讨其对Hp 损伤GES-1 细胞的修复作用，从而为天然植物活性成分在对Hp 引起胃黏膜损伤的修复作用方面提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

幽门螺杆菌（Hp）、人永生化胃黏膜上皮细胞（human gastric epithelial cell line，GES-1）：南方医科大学南方医院消化科；复合多糖：无限极（中国）有限公司；白术、白扁豆、陈皮、山药：安国市一方药业有限公司；无菌脱纤维绵羊血：广州鸿泉生物科技有限公司，批号180820；CM0331B 哥伦比亚血琼脂基础、脑心浸液（brain heart infusion，BHI）：广州翔博生物科技有限公司；DMEM 培养基、含0.01%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的0.25%胰蛋白酶（批号C11995500BT）、双抗（青霉素、链霉素）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）批号 730840：Gibco 公司；革兰染色液试剂盒：青岛海博生物技术有限公司，批号HB8278；MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，批号C0009。

1.2 仪器与设备

C-31 型厌氧培养罐（细菌）：上海慧颖生物科技有限公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；TOMY SX-700 型高压灭菌锅：上海鼎谦生物科技有限公司；UV754N 型紫外可见光分光光度计：INESA 上海仪电分析仪器有限公司；BDS200 型倒置相差显微镜：日本Olympus 公司；ST16 型离心机：赛默飞世尔科技公司；FA2204 型万分之一电子天平：上海安亭科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中药提取物的制备

称取中药原料15 g，粉碎过60 目筛，按料液比1∶20（g/mL）加去离子水，在 80 ℃下回流提取 2 h。过滤、弃去滤渣，在5 000 r/min 条件下离心10 min，减压浓缩，冷冻干燥，得到中药提取物，干燥保存，备用。

1.3.2 Hp 活菌悬液的制备

Hp 培养于含有10%FBS 的哥伦比亚培养基中，置于 37 ℃含 5%O2、10%CO2、85%N2的饱和湿度环境，培养48 h 用于试验或传代。将Hp 刮取收集于含10%FBS 的BHI 培养液中，为Hp 活菌悬液。酶标仪检测 600nm 下 OD600值，以 OD600=1 为 1.0×109cfu/mL[18]，确定Hp 菌悬液浓度。

1.3.3 提取物对GES-1 细胞增殖的测定

用胰酶消化对数生长期的GES-1 细胞制成单细胞悬液，计数，以每孔1×104的量接种至96 孔板中，每组设置6 个复孔，置于37 ℃5%CO2培养箱内孵育16 h。加入不同浓度中药提取物，继续孵育24 h。为防止药物与噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）反应影响显色，则需弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗 2～3 遍后，再加入 5 g/L MTT 溶液 20 μL，再孵育4 h。弃去上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，振荡溶解结晶，在570 nm 下测定OD 值[19]。计算GES-1 细胞存活率。

1.3.4 Hp 抑制试验

用0.1%的二甲基亚砜充分溶解中药提取物后，再溶于含10%FBS 的BHI 培养液中配成不同浓度的药液，过 0.22 μm 滤膜，备用。

在 24 孔板中加入 10 μL Hp 菌悬液（109cfu/mL）以及990 μL 不同浓度的药液，阴性对照组加入不含药物的BHI 培养液和Hp 菌悬液，阳性对照组则加入含100 μg/mL 阿莫西林和 50 μg/mL 克拉霉素混合抗生素[20]的BHI 培养液和Hp 菌悬液。37 ℃微需氧条件下培养24 h 后，适当稀释，取50 μL 转至哥伦比亚血琼脂培养基上，培养48 h 后计数菌落[21]。

1.3.5 体外抑制脲酶活性试验

分别将脲酶溶液（10 U/mL）与不同浓度的药物溶液（125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL）各 100 μL混匀至1.5mL离心管中，于37 ℃避光反应20 min。加入 50 mmol/mL 尿素 100 μL，在 25 ℃下避光反应 20 min。加入贝特洛显色液并摇匀，在25 ℃避光反应10 min。吸取 150 μL 至 96 孔板中，测定 595 nm 处的 OD 值。每个浓度的药物平行操作3 次。空白对照组加入相应溶液的溶剂[22]。根据公式计算出剩余酶活性，运用SPSS 统计软件求得药物的IC50。

1.3.6 对Hp 感染损伤GES-1 细胞的影响

在含有10%FBS 及1%抗生素的培养液（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）中孵育 GES-1细胞，当细胞生长达到80%融合时，用胰酶消化处于对数生长期的GES-1，计数细胞，以每孔105个/L 的浓度接种于96 孔板上培养过夜。用1.0×109cfu/mL 浓度的 Hp 与 GES-1 细胞按照 100∶1 的体积比共培养 24 h，建立Hp 损伤GES-1 细胞模型[23]。然后，加入不同浓度提取物 100 μL，继续培养 12、24、36、48 h 后，光学显微镜下观察GES-1 细胞形态的变化，MTT 法检测计算细胞存活率。

1.4 数据处理与统计分析

所有数据均独立平行测定3 次，数据结果以平均值±标准差（mean±SD）的形式表示，采用 SPSS 24.0 软件对试验数据进行统计学分析，通过独立样本t 检验做显著性分析，P ＜0.05 为有统计学意义，图表采用GraphPad Prism 5 进行绘制。

2 结果与分析

2.1 不同中药提取物对GES-1细胞的影响

图1 为不同中药提取物以及复合多糖对GES-1细胞增殖的影响。

图1 不同中药提取物对GES-1 细胞增殖的影响Fig.1 Effect of herb extracts on the GES-1 viability

其中，砂仁和白术提取物对GES-1 细胞的增殖没有显著影响（P ＞0.05）。陈皮提取物对GES-1 细胞的增殖表现出抑制作用，且随着浓度升高，对细胞增殖的抑制作用增强。在浓度达到125.00 μg/mL 以上时，开始对GES-1 细胞生长产生明显的抑制作用。在500.00 μg/mL 浓度时，GES-1 细胞的存活率已经下降到90%左右。

复合多糖和白扁豆提取物，对GES-1 细胞增殖有一定的促进作用，且呈剂量依赖效应。当浓度达到15.62 μg/mL 以上时，二者对细胞的增殖作用均开始产生显著影响。在500.00 μg/mL 浓度时，复合多糖和白扁豆组的GES-1 细胞存活率分别达到122.15 %和125.80%。因此，在所有受试原料中白扁豆提取物促进GES-1 细胞增殖的作用最为显著，后续试验针对白扁豆提取物开展进一步的研究。

2.2 白扁豆提取物对幽门螺杆菌的抑制作用

白扁豆性微温、味甘，归脾、胃经。据《名医别录》记载，白扁豆“和中下气”，可升清降浊，有调肝和胃的功效[24]。现代研究表明，白扁豆在抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等方面均有重要的作用。Ye 等[25]从白扁豆中提取出一种抗菌蛋白，可抑制丝核菌和镰刀霉菌等，且对人类免疫缺陷病毒表达过程中的相关蛋白酶具有抑制作用。不同浓度白扁豆提取物对Hp 的抑制作用见图2。

图2 不同浓度白扁豆提取物对Hp 的抑制作用Fig.2 Inhibition of Dolichos bean seeds extract on Hp

如图2 所示，白扁豆提取物对Hp 也有明显的抑制作用，且呈现明显的剂量-效应关系。15.62 μg/mL 白扁豆提取物作用24 h 后，Hp 数量已由对照组的1.77×107cfu/mL 下降到 6.60×106cfu/mL，抑制率达 62.61 %，与对照组相比的差异高度显著。

2.3 白扁豆提取物对脲酶活性的影响

白扁豆提取物对脲酶活性的抑制作用见图3。

脲酶是Hp 的主要致病因子之一，与Hp 的活性密切相关。Hp 能通过分泌脲酶来分解胃中存在的少量尿素，因而产生的氨能中和部分胃酸以提高Hp 周围的pH值，便于Hp 在胃部的高酸性环境下定殖。而且，Hp还能通过产生脲酶以促使胃上皮GES-1 细胞凋亡[26-27]。因此，通过抑制脲酶活性可减弱Hp 的致病性。如图4所示，白扁豆提取物可明显抑制脲酶活性，并呈现明显的剂量-效应关系。白扁豆提取物在500 μg/mL 浓度下，对脲酶的抑制率已达到82%。白扁豆提取物抑制脲酶活性的半数抑制浓度IC50值为397.14 μg/mL。因此，白扁豆提取物可能通过抑制Hp 所产生脲酶的活性，减弱Hp 在胃部的定殖能力，并降低脲酶这一毒力因子对胃部的损伤，从而最终缓解Hp 对胃部的损伤。

图3 白扁豆提取物对脲酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibition of Dolichos bean seeds extract on urease activity

2.4 白扁豆提取物对Hp损伤GES-1细胞的修复作用

正常的GES-1 细胞形态多数呈扁平三角形或多边形，或近似梭状，小岛状增殖，贴壁生长。但Hp 与GES-1 细胞共培养24 h 后，大多细胞的棱角消失，胞浆收缩，形态变圆；细胞之间的连接性降低，贴壁不充分，偶有脱离现象；部分细胞死亡，培养液中出现悬浮的细胞碎片。说明Hp 影响了GES-1 细胞的形态，对GES-1 细胞的生理活性具有一定损害作用，从而抑制了GES-1 细胞的生长。

不同浓度白扁豆提取物对Hp 损伤GES-1 细胞存活率的影响见图4。

图4 不同浓度白扁豆提取物对Hp 损伤GES-1 细胞存活率的影响Fig.4 Effect of Dolichos bean seeds（DBS）extract on the Hpinjured GES-1 cells

在已被Hp 侵染24 h 的GES-1 细胞中加入白扁豆提取物，36 h 后可见GES-1 细胞形态开始逐渐恢复常态，贴壁的GES-1 细胞数量增多。同时，细胞存活率也开始逐渐发生变化（图4）。在较短时间（＜24 h）内，较低浓度（10 μg/mL～100 μg/mL）的白扁豆提取物，并不能对Hp 损伤GES-1 细胞的增殖产生明显影响（P ＞0.05）。但随着作用时间延长，GES-1 细胞存活率仍有明显增加。以10 μg/mL 白扁豆提取物作用48 h 后，GES-1 细胞存活率已由模型组的74.77 %提高到87.11%（P ＜ 0.05）。50 μg/mL 白扁豆提取物作用 36 h后，GES-1 细胞的存活率已可提高至100%，达到修复完全的效果。而高浓度白扁豆提取物的修复作用，在短时间内即可显现。以500 μg/mL 白扁豆提取物作用12 h 后，GES-1 细胞存活率已达到95%以上，显著高于模型组的89.86%（P ＜0.05），且能较稳定地维持细胞生长。

因此，白扁豆提取物对受Hp 侵染损伤的GES-1细胞具有良好的修复作用，且呈现明显的剂量、时间和效应的关系。说明，白扁豆提取物对Hp 感染引起的胃部损伤，具有较好的修复作用。

3 结论

对数种中药提取物进行筛选后发现，白扁豆提取物对GES-1 细胞的促增殖作用最为显著，在500.00 μg/mL 浓度作用下GES-1 细胞存活率可提高到125.80%。同时，白扁豆提取物可有效抑制Hp 生长以及脲酶活性，且呈现剂量-效应关系。以15.62 μg/mL白扁豆提取物作用24 h 后，对Hp 抑制率达62.61%；白扁豆提取物对脲酶活性的IC50值为397.14 μg/mL。以Hp 侵染GES-1 细胞24 h 建立GES-1 细胞损伤模型，经500 μg/mL 白扁豆提取物作用12 h 后，GES-1细胞存活率可达到95%以上。说明，白扁豆提取物可能通过促进GES-1 细胞增殖同时抑制Hp 及脲酶活性，来修复Hp 损伤的GES-1 细胞，从而对Hp 感染引起的胃部损伤起到修复作用。