酸角果肉多糖的提取工艺优化与初级结构分析

胡浩，郭瑞，李季楠，吴雪娇，吴艳

（上海交通大学农业与生物学院，上海200240）

酸角，又名酸豆，罗望子（Tamarindus indica L.），为豆科酸角属[1]。酸角原产自非洲，主要分布在印度、缅甸等国，在我国主要分布于广西、福建、四川、海南和云南等省份[2-3]。酸角果实由果皮、果肉、种子以及纤维组成，其中果肉占比45%～55%[4]，果肉含有酒石酸、还原糖、纤维和单宁等，同时富含矿物质及维生素[5]，酸角果肉的制备物具有抗氧化[6]、抗菌性[7]和抗糖尿病[8]等作用，是酸角中最有价值的部分。国内外学者多研究酸角果肉的营养成分及功能，而对于酸角果肉多糖（polysaccharides from Tamarindus indica L.Pulp fruit，PFTP）的提取及结构的研究很少。

王玲[9]研究了热水浸提法制备PFTP 的最佳参数，研究说明在浸提温度 90 ℃、液料比 30∶1（mL/g）、pH为6.0、浸提时间为90 min 时，提取条件最优，多糖得率达17.18%。然而传统的热水浸提法提取多糖，不但提取率低、能耗大，且提取的时间较长，会对多糖的结构造成一定程度的破坏。超声波辅助提取法的空化作用，引发机械性震动等次级效应，促使胞内的溶质进一步释放；同时具有条件温和、提取时间短等优点，可大大提高提取得率[10-11]，故在多糖的制备中有着较普遍的应用。

通过超声波辅助提取法制备酸角果肉中的多糖，探索提取时间、超声功率、提取温度与液料比四因素与提取得率的关系，后采用响应面分析法改进其工艺参数。探索超声波辅助提取法与热水浸提法提取酸角果肉多糖的异同，结合紫外光谱分析（ultraviolet spectrum，UV）、红外光谱分析（infrared spectrum，IR）与离子色谱法等方式对PFTP 的结构进行初步解析，为酸角果肉的研究利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酸角：来源于猫哆哩集团（云南）有限责任公司。剥离果肉后干燥，粉碎成粉后备用。

无水乙醚、无水乙醇、硫酸、葡萄糖、苯酚：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

旋转蒸发仪：R206B 型，上海申生科技有限公司；高速粉碎机：SF-2000 型，上海市药材有限公司；台式低速离心机：TD5A-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；紫外可见分光光度计：U1810 型，北京普析通用仪器有限责任公司；傅里叶红外光谱仪：Nicolet 6700 型，苏州佐藤精密仪器有限公司；数控超声波提取机：THC 型，济宁天华超声电子仪器有限公司；真空冷冻干燥机：VFD-2000 型，上海比朗仪器有限公司；电热恒温水浴锅：HWS24 型，上海恒科学仪器有限公司；高效液相色谱仪：Waters e2695，美国沃特世公司。

1.2 方法

1.2.1 PFTP 的超声波辅助制备过程

干燥酸角果肉→无水乙醚→乙醇→超声波→旋转蒸发→乙醇沉淀→丙酮、乙醇依次冲洗→复溶→真空冷冻干燥→酸角果肉多糖

酸角果肉多糖的制备：将酸角果肉充分干燥，粉碎后加入10 倍体积的无水乙醚，搅拌1 d，更换无水乙醚2 次，烘干后得到脱脂的酸角果肉；再向酸角果肉中添加10 倍的95%乙醇，浸泡1 d，可除去低聚糖以及小分子等物质，烘干后得到预处理的酸角果肉粉。

取4 g 酸角果肉处理粉，以去离子水为溶剂，依照不同的超声时间、液料比与超声功率进行超声，再进行低速离心，将所得沉淀按照同等条件复提1 次，合并两次所得上清液，将上清液进行旋转蒸发，后加入95 %乙醇溶液，4 ℃下放置12 h，沉淀析出多糖，分别利用丙酮、乙醇冲洗若干次，离心后将沉淀加水复溶，离心除去复溶液中的蛋白质和杂质，最后对上清液进行冷冻干燥，即得到酸角果肉多糖。

1.2.2 酸角果肉多糖的热水制备过程

干燥酸角果肉→无水乙醚→乙醇→热水浸提→旋转蒸发→乙醇沉淀→丙酮、乙醇依次冲洗→复溶→真空冷冻干燥→酸角果肉多糖

热水浸提酸角果肉多糖的前处理同1.2.1 所述，烘干得到预处理酸角果肉粉，后称取4 g 酸角果肉处理粉，按照王玲[9]优化的提取工艺参数进行提取，经低速离心，复提，合并上清液，旋蒸，向所得液中加入4 倍体积的95%乙醇，静置12 h 后析出多糖，分别用丙酮、乙醇洗涤，离心后将沉淀加水复溶，进行高速离心，最后对所得的上清液进行冷冻干燥，即得到热水浸提的酸角果肉多糖。

1.2.3 PFTP 得率计算方式

使用苯酚-硫酸法[12]。标准品为葡萄糖溶液，得率计算方法如下所示：

式中：C 为多糖质量浓度，μg/mL；V 为提取液的体积，mL；n 为提取液稀释倍数；m 为所取的干燥前处理粉质量，g。

1.2.4 单因素试验

进行初级试验后，确定单因素试验各变量的区间范围。本试验利用去离子水作为溶剂，分别研究提取时间、超声功率、提取温度以及液料比4 项因素的大小与PFTP 提取得率的变化关系。

1.2.5 响应面试验设计

基于单因素试验，设置自变量为提取时间（A）、超声功率（B）、提取温度（C）与液料比（D），响应值为PFTP 得率，利用Design expert 8 程序设定四因素三水平响应面组合试验，并优化其超声波辅助提取的工艺参数。具体试验因素水平如表1 所示。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Table of factors＆level in response surface analysis

1.2.6 PFTP 的紫外光谱分析

配置热水浸提酸角果肉多糖与PFTP 溶液各0.2 mg/mL，进行紫外光谱扫描，波长范围为：190 nm～400 nm。

1.2.7 PFTP 的红外光谱分析

分别取1.0 mg 热水浸提酸角果肉多糖与PFTP，与KBr 充分混匀，进行红外光谱扫描，区域范围为：4 000 cm-1～400 cm-1。

1.2.8 PFTP 的单糖组成研究

准确称取5 mg PFTP 样品于5mL的具塞试管内，加入 1mL2 mol/L 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），121 ℃烘箱中水解2 h，用水定容至50 mL，通过0.45 μm微孔滤膜后供进样分析[13]。

使用高效阴离子交换色谱法，设置检测条件为检测器：脉冲安培检测器；色谱柱：CarboPac PA20；流动相：A，H2O；B，250 mmol/L NaOH；C，1 mol/L NaAc；流速：0.5 mL/min。

1.2.9 PFTP 的分子量测定

使用高效体积排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC） 测定 PFTP 的分子量，仪器装备紫外检测器（UV）、示差折光检测器（refractive index detector，RI）以及激光直角光散射检测器（right angle laser light scattering detector，RALLS）等。色谱柱：TSK gel G6000 PWXL（13）7.8 ×300+TSK gel G6000 PWXL（10）7.8 ×300，柱温：35 ℃，流动相：0.15 mol/L NaNO3+0.05 mol/L NaH2PO4·2 H2O，流速：0.5 mL/min，洗脱时间：60 min，数据分析软件ASTRA 6.1。

1.2.10 PFTP 糖醛酸的定量检测

当多糖中含有较多的糖醛酸时，利用硫酸-咔唑法检测其含量会受到中性糖的影响，不能反映其含量的真实值[14-15]，本试验采用改良的间羟联苯法[16]测定PFTP 的糖醛酸含量。

配置超声波辅助提取所得的PFTP 溶液1 mg/mL，利用半乳糖醛酸配置所需标准样品，得到标准曲线，利用间羟联苯法准确检测糖醛酸的真实含量。

1.2.11 数据处理

进行3 次平行试验，检测多糖溶液的吸光度值，得率如1.2.3 公式计算，利用Excel 与Design expert 8 软件分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 PFTP的单因素试验结果

PFTP 的单因素试验结果如图1 所示。

图1 单因素与PFTP 得率的关系曲线Fig.1 Relationship between independent variables and extraction yield of PFTP

2.1.1 超声提取时间对PFTP 得率的影响

由图1a 可知，在 10 min～40 min 区间内，PFTP 得率与时间呈正相关，时间大于40 min 后，得率开始下降。这可能是因为10 min～40 min 区间内，超声波对细胞的作用时间增加，导致细胞裂解破碎，使多糖的溶出更充分；同时，溶剂与多糖的不断接触，加快了多糖的扩散速度，得率随之增加。提取时间过长时，多糖的结构可能发生破坏而成为单糖，不溶性的物质也会在细胞破裂后悬浮在溶剂中，使其渗透性下降[17-18]，造成多糖含量减少。故本研究选取提取时间为40 min。

2.1.2 超声提取功率对PFTP 得率的影响

由图1b 可知，当超声功率为200 W 时，得率最大，超声功率在200 W～360 W 时，得率与超声功率呈反相关。可能在一定大小的功率区间内，超声波的空化作用与破壁效应与超声波功率呈正相关，加速细胞壁的分解并通过微喷射形成和声流促进细胞内物质溶出；超声功率过大时，可能会导致局部溶液瞬时温度过热，使多糖裂解、黏度下降等，同时可能会导致空化期间溶剂中的气泡数量增加，从而降低传输到介质中的超声能量的效率，导致多糖得率开始下降[19-20]。故本研究选取超声功率为200 W。

2.1.3 超声提取温度对PFTP 得率的影响

由图1c 可知，温度在 30 ℃～50 ℃区间内，PFTP 得率与温度呈正相关，50 ℃时达到最高，50 ℃～70 ℃区间内，随温度增加，PFTP 得率逐渐下降。这可能是因为温度在50 ℃以下时，多糖未能充分溶解，温度升高导致超声波空化效应及多糖扩散效果显著增强，故得率逐渐增加。当温度超过50 ℃时，由于温度过高，一方面可能造成部分多糖的分解，另一方面高温会导致表明张力下降和微气泡内蒸气压的增加，导致超声波阻尼效应的产生，使得率有所下降[21-22]。故本研究选取提取温度为50 ℃。

2.1.4 液料比对PFTP 得率的影响

由图1d 可知，液料比在 10∶1（mL/g）～30∶1（mL/g）区间内，得率随着液料比的增加而增加，在30∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）的区间，得率随着液料比的增加而逐渐下降。这可能是因为随料液比的逐渐上升，多糖扩散的压力差变大，有利于多糖的扩散溶解，得率增大；随溶剂的继续增加，溶剂与原料的高比例延长了朝内部组织扩散的距离，提取液中超声波能量密度分布的减少是其主要的影响因素，通过阻碍多糖的溶解而对提取率造成反向影响，空化作用也可能随着介质黏度的增强而更难产生，故得率略微下降[22-23]。本研究选取液料比 30∶1（mL/g）。

2.2 PFTP超声波辅助提取的响应面分析

2.2.1 响应面分析的试验结果

基于单因素试验的结论，选定提取时间、超声功率、提取温度和液料比4 个因素，分别记作A、B、C、D，得率记作Y，在单因素最优值的基础上采用四因素三水平设计，响应值为PFTP 得率，使用Design-Expert 8.0 程序中的Box-Behnken 原理进行响应面的试验设计，响应面试验组别及对应结果见表2 所示，共计29个组别。

表2 PFTP 的响应面试验设计和得率Table 2 Response surface experimental design and extraction yield of PFTP

续表2 PFTP 的响应面试验设计和得率Continue table 2 Response surface experimental design and extraction yield of PFTP

通过Design-Expert 8.0 的数据处理，得到PFTP 得率与4 个变量的多元回归方程如下：

Y=31.16+1.82A+1.96B+2.56C+1.14D-0.21AB-0.51AC-0.30AD-0.36BC-1.24BD+1.22CD-3.71A2-5.12B2-4.04C2-3.91D2

如表3 所示可知，回归模型P＜0.000 1，证明此模型极为显著，各因素与其响应值之间显著相关。A、B、C、D 的P 值皆小于0.000 1，表明这4 项单因素对PFTP的得率都有着极为显著的影响，BD、CD 的 P＜0.05，表明此两项交互项对得率有着显著的影响；根据F 值判断，4 项因素对PFTP 影响程度从大到小排序为：C＞A＞B＞D。模型多重相关系数R2=0.984 0，亦证明了模型相关性良好，是准确的；失拟项的P 值为0.121 5，失拟项不显著，故回归模型可以接受[18]。

表3 响应面分析试验回归模型-方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

综上所述，该回归模型可很好的应用于分析PFTP的超声波辅助制备方法。

2.2.2 超声波辅助提取PFTP 得率的响应面分析结果

响应面分析可得到等高线图以及3D 曲面图，结果如图2 所示。等高线图可清晰表征各参数与响应值的关系强弱，以得出最优参数。通过观察响应面3D 图曲面的坡度与等高线的密度，可以得出两因素交互作用的显著程度。一般影响程度与坡度、等高线、椭圆化程度成正相关。随着变化坡度变化幅度的增加，曲面图的颜色会逐渐加深[24]。

图2 交互作用对得率的影响Fig.2 The effect of interaction on extraction yield

从图2 中可以看出，对PFTP 得率影响最显著的因素为C（提取温度）与A（提取时间），图中显示为曲线较陡，颜色较深；B（超声功率）次之，D（液料比）影响最小。

2.2.3 最佳提取条件的确定与验证

根据上述多元回归方程，利用模型预测其理论最优提取条件是：在53.25 ℃温度下，使用206.41 W 超声，液料比 32∶1（mL/g），提取 42 min、此参数条件下PFTP 得率可达32.01%。考虑到实际应用可行性，选取最佳参数：50 ℃下，200 W 功率超声40 min、液料比30∶1（mL/g）。

在上述优化条件下，3 次平行试验得出PFTP 平均得率为31.94%，与理论预测值相近，表明此回归方程能准确反映以上4 项因素对PFTP 提取得率的影响，同时表明响应面法改进的制备参数可用于实际应用。

2.3 超声波辅助提取PFTP与热水浸提PFTP的得率对比

由文献[9]条件，90 ℃下提取 90 min、令 pH 为 5.0、液料比为20∶1（mL/g），此时热水浸提酸角果肉多糖的得率最大；在此条件下，按照1.2.2 提取酸角果肉多糖，得出平均得率为23.44 %，大于文献中的得率17.18%，这可能与原材料处理方式等不同有关。具体对比如表4 所示。

表4 超声波辅助提取PFTP 与热水浸提PFTP 得率的对比Table 4 Yield of PFTP by ultrasonic extraction and traditional hot water extraction

由表4 可知，超声波辅助提取法的温度较低，时间较短，可较大程度提高提取得率。由此可知，超声波辅助提取法较热水浸提法效益更高，更加节约能源，有较大的应用价值。

2.4 PFTP的紫外光谱吸收

PFTP 的紫外光谱吸收结果如图3 所示。

由图3 PFTP 和热水浸提酸角果肉多糖的紫外吸收光谱图可知，在190 nm 左右，二者皆出现较明显吸收峰，为多糖特有吸收峰。在280 nm 左右，二者都出现一个较弱的吸收峰，这表明两种提取方式所取得的样品中都具有少量蛋白质，经检测，其蛋白质含量分别为1.30%与1.78%。在260 nm 左右无吸收峰，表示样品中无核酸[25]。两种提取方式所得PFTP 的紫外吸收光谱图形态上基本相同。

图3 超声波辅助提取PFTP 与热水浸提PFTP 的紫外吸收光谱Fig.3 UV spectra of PFTP extracted by ultrasonic and hot water

2.5 PFTP的红外光谱吸收

PFTP 的红外光谱吸收结果如图4 所示。

图4 超声波辅助提取PFTP 与热水浸提PFTP 的红外吸收光谱Fig.4 IR spectra of PFTP extracted by ultrasonic and hot water

由图4 可知，3 600 cm-1～3 200 cm-1处具有明显宽峰，为 O-H 的伸缩振动，3 000 cm-1～2 800 cm-1的峰是由于C-H 的伸缩振动，上述两区域的峰是糖的特征吸收峰，PFTP 与热水浸提酸角果肉多糖都具备此特征峰。1 880 cm-1与1 733 cm-1吸收峰是C=O 伸缩振动，1 601 cm-1处的峰为C=O 非对称伸缩振动，1 407 cm-1处的峰是C-O 伸缩振动，1 339 cm-1处的峰为C=O对称伸缩振动，1 300 cm-1～1 000 cm-1范围内的峰为C-O 变角振动，表明PFTP 含有羧基结构。1 150 cm-1～1 060 cm-1范围内的峰为C-O 伸缩振动所致。879 cm-1处是 β 吡喃糖 C-H 变角振动吸收峰；904 cm-1与843 cm-1处的吸收峰表明PFTP 具有葡萄吡喃糖结构[16]。790 cm-1和 688 cm-1处的峰是 C-H 面外吸收振动所致，480 cm-1～620 cm-1区域的峰是 C-X 的伸缩振动所致。

红外光谱分析表明，超声波辅助提取的PFTP 具有糖醛酸，在1 733 cm-1和1 259 cm-1的吸收峰，表明有-COOR 存在，说明PFTP 是一种酸性多糖[16]。

通过PFTP 与热水浸提酸角果肉多糖的红外图谱可知，热水浸提酸角果肉多糖的红外光谱C=O 伸缩振动峰消失，O-H 变角振动峰数目减少，PFTP 在1 601、1 733、1 258 cm-1处有强吸收峰，表明其具有一定的羧基与酯基。热水浸提酸角果肉多糖在1 733 cm-1处无明显吸收峰，表示其羧基中C=O 非对称伸缩结构大量减少，1 620 cm-1与1 262 cm-1处的峰变弱，表明热水浸提法可能对酯基、羧基造成较大的破坏[26]。总体看来，热水提取的PFTP 峰的数量大大减少，同时峰的程度有所减弱，对PFTP 的羧基以及主链结构等的破坏较大，可能使酸角果肉多糖甲酯化程度减弱。

2.6 超声波辅助提取PFTP的单糖组成

对比各单糖标样的出峰时间与面积，结果见图5。

图5 PFTP 的高效阴离子交换色谱Fig.5 High performance anion exchange chromatogram of PFTP

由图5 可知，超声波辅助提取所得PFTP 主要由阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fru）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Gal）和半乳糖醛酸（GalA）组成，其中阿拉伯糖、半乳糖与葡萄糖含量最多，故葡聚糖与阿拉伯半乳聚糖或为PFTP 的主要多糖成分，相应单糖的摩尔比为 45.56∶15.67∶6.41∶1∶5.14∶14.27∶1.95。

2.7 分子量测定结果

PFTP 的分子量测定结果表明，PFTP 的重均分子量为8.262×105g/mol，分散程度可用Mw/Mn 的比值表示，Mw/Mn 为1 时，表明多糖的组分均一，分子量分布较窄，其值越大，则分子量分布越宽，分散度越大[27]；PFTP 的Mw/Mn 值为1.248，说明PFTP 的分子量分布较为均一。

2.8 糖醛酸测定结果

采用间羟联苯法测定糖醛酸含量，标准曲线测定结果如图6 所示。

图6 糖醛酸含量的标准曲线Fig.6 Standard curve of uronic acid content

线性回归方程为y=0.002 8x+0.006 7，线性系数R2=0.991，即两变量具有良好的相关性，根据此方程计算得出PFTP 的糖醛酸平均含量为30.02%，表明PFTP 为一种酸性杂多糖，这与红外光谱的检测结果相一致。

3 结论

本研究依照单因素试验结论，选用响应面法改进了超声波辅助提取法制备酸角果肉多糖的参数，结果表明50 ℃下，200 W 超声提取40 min，液料比为30∶1（mL/g），此时得率为 31.94%，高于热水浸提法，证明超声波辅助提取法提取PFTP 是一种高效、节能的提取方式。通过紫外光谱检测得出PFTP 中含有少量的蛋白质，无核酸；通过红外光谱检测表明PFTP 含有羧基、β-糖苷键结构，可能是一种酸性多糖；对比热水浸提法所得酸角果肉多糖与PFTP，除得率不同外，紫外吸收光谱图大致相同，红外光谱显示热水浸提法可能对酸角果肉多糖的酯基及羧基破坏较多，可能会对多糖的酯化度产生影响；高效阴离子色谱法测得PFTP 主要由阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fru）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Gal）和半乳糖醛酸（GalA）组成，相应的摩尔比为45.56∶15.67∶6.41∶1∶5.14∶14.27∶1.95；多糖的分子量测定结果显示PFTP 的分子量为8.262×105g/mol，且分布均一；通过间羟联苯法测得其半乳糖醛酸的真实含量为30.02%，这一结果与红外光谱所测PFTP 可能是一种酸性多糖吻合。