靶向超声分子成像在小鼠动脉粥样硬化斑块模型中的应用

宋爽 胡彬 王飞阳 姚立红 刘敏

1 牡丹江医学院附属红旗医院超声科 （黑龙江 牡丹江 157011）

2 牡丹江医学院附属红旗医院肿瘤科 （黑龙江 牡丹江 157011）

3 牡丹江医学院附属红旗医院向阳社区彩超室 （黑龙江 牡丹江 157011）

4 牡丹江医学院附属红旗医院血液科 （黑龙江 牡丹江 157011）

内容提要： 目的：本研究旨在通过靶向超声分子成像评估小鼠动脉粥样硬化斑块的早期诊断。方法：将40只载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠和40只C57BL/6野生型小鼠随机分为4组，每组20只。实验组小鼠喂饲高胆固醇饲料20周后，制备靶向超声微泡。结果：应用靶向超声分子成像技术对有动脉粥样硬化斑块的小鼠进行研究，并与红油O染色体进行了比较。动脉粥样硬化斑块的靶向超声分子成像结果表明，血小板膜糖蛋白IIb/IIIa受体（GP IIb/IIIa），亦称αIIbβ3整合素，是早期诊断动脉粥样硬化斑块的有效生物标志物。结论：靶向超声分子成像作为一种无创、有效地识别动脉粥样硬化进展的方法，具有广泛的应用前景。

靶向超声分子成像是基于不同分子配体和造影剂形成的超声造影剂，能够在分子和细胞水平上特异性地揭示血管壁的病理变化，同时将包被基因和药物运输到靶区域[1]。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的基本病理机制之一，被认为是一种慢性炎症性疾病。它刺激血小板活化，并促进炎症反应，进而促进导致易损斑块形成的循环。在易损斑块的形成中，斑块炎症和动脉血栓形成是最重要的病理现象。

据统计，世界上死于心脑血管疾病（CCVD）的人数高达1500万，被认为是人类生命的“头号杀手”。Rutten-Jacobs等人证实，老年男性的CCVD与代谢和性激素水平有关，并发现这两个参数都会影响动脉斑块[2]。本研究的目的是评价靶向超声分子成像在检测小鼠动脉粥样硬化斑块中的有效性[3]。

1.材料与方法

1.1 材料

APOE-/-小鼠和C57BL/6野生型小鼠；高胆固醇小鼠饲料和普通小鼠饲料；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-马来酰亚胺（DSPE-PEG 3400-Maleinide）、氨基硫代丙酸、马来酰亚胺、聚乙二醇4000（PEG4000）、含饱和脂肪酸的二棕榈酰卵磷脂（DPPC），普洛沙姆-188、丙烷气和戊巴比妥钠溶液（由牡丹江医学院附属红旗医院提供）；蒸馏水；磷酸缓冲盐溶液（PBS）、多聚甲醛固定液（PFA）；油红O染色体（购自北京百奥莱博生物科技有限公司）；异丙醇溶液（购自上海艾万拓化工产品贸易有限公司）。本研究使用的仪器有：高速剪切机、手术显微镜、纤维角膜剪、超声机、小动物超声探头（由牡丹江医学院红旗医院提供）、玻片染色缸和超声造影图像分析系统（MCE2.7）。

1.2 动物

将40只ApoE-/-小鼠和40只C57BL/6野生型小鼠随机分为4组：A组：20只ApoE-/-小鼠，给予标准饲料和自由饮水；B组：20只ApoE-/-小鼠，给予高胆固醇饮食和自由饮水；C组：C57BL/6野生型小鼠20只，给予标准饲料和自由饮水；D组：20只C57BL/6野生型小鼠，给予高胆固醇饮食和自由饮水。将动物圈养在温度（19～23˚C）和湿度（32%～55%）的笼子中，12h光照/黑暗循环。喂养20周后，每组取4只小鼠进行腹主动脉粥样硬化模型试验，其余小鼠进行靶向超声分子成像检测。

1.3 靶向超声微泡的制备

由牡丹江医学院附属红旗医院人工合成环状五肽序列，分别与DSPE-PEG 3400-Maleinide和马来酰亚胺通过巯基和二硫键进行共价连接。用高速剪切装置从乳状液中制备靶向超声微泡。用同样的方法制备与环状五肽相似的非特异性多肽，并将其作为对照微泡。

1.4 腹主动脉标本采集

手术显微镜下仔细分离小鼠的腹主动脉，将腹主动脉纵向分开并铺在干净的滤纸上。滤纸与动脉标本一起浸泡于3%PFA溶液中固定，3d后取出。

1.5 动脉粥样硬化小鼠模型

将清洗后的样品放入装有60%异丙醇溶液的染色缸中浸泡10min。浸泡后取出标本。该过程重复6次。当腹主动脉斑块面积变红而无斑块区域变白时，用自来水清洗标本，放置在清洁区域上并拍照。

1.6 小鼠腹主动脉的超声显像

固定并调节超声探头：参数保持不变。每组16只小鼠，随机分为两组。一组注射靶向超声微泡，另一组注射对照微泡收集图像。测量所有图像的超声强度并对图像进行彩色编码处理。

1.7 统计学分析

2.结果

2.1 动脉粥样硬化小鼠模型

动脉粥样硬化斑块染色结果显示，A组和B组斑块明显呈红色，而C组和D组缺少相似的斑块。D组出现一些脂肪条纹（图1）。评估斑块面积与全血管相比的尺寸，结果显示，A组和B组显著增加（P＜0.05），B组较A组增加更明显，说明B组是成功的模型。

图1. 四组染色类型试验

图2. 四组超声成像

2.2 小鼠腹主动脉超声显像

对4组超声造影结果的显示，B组腹主动脉超声检查获得相关结果（图2，B1），其余3组均未见明显的异常，B组腹主动脉超声检查结果与B组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。图2可以看出，主动脉和循环组织均可充盈。随着造影剂的减少，B组靶向微泡的滞留情况优于其他两组。

3.讨论

靶向超声分子成像在动脉粥样硬化性疾病的早期诊断和病理靶向治疗中具有长期的应用前景[4]。近年来，靶向超声分子与超声造影相结合为研究靶组织器官的分子病理学特征开辟了新的方向[5]。

动脉粥样硬化是随着促进单核细胞聚集和溢出的信号分子而逐渐形成的[6]。因此，血小板的活化可以促进动脉粥样硬化的形成。超声分子成像可以定量和可视化血小板活化相关的分子位置。我们用血小板GP Ib和GP IIb/IIIa受体作为易损斑块的生物标记物[7]。通过配体与受体的特异性结合，这些受体与血液中大量的纤维蛋白原结合。上述过程是血小板聚集和血栓形成的初级阶段的共同最终途径。该途径在动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成的早期起重要作用[8]。

该项研究表明，主动脉粥样硬化对靶向超声分子成像有反应。随着斑块类型的不同，模型中的反应性也不同。

综上所述，靶向超声分子成像在主动脉粥样硬化的诊断和治疗中具有广阔的应用前景。