复方透骨香乳膏中黄柏的质量控制研究

郭璐玫 姜 莲 申 璀

贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004

复方透骨香乳膏由透骨香、黄柏、川芎、当归等11味药材组成，具有活血祛瘀、消肿止痛之功效，用于跌打损伤所致的局部软组织损伤、疼痛。方中黄柏为主要药味，具有明显的消肿作用。实验以黄柏对照药材和盐酸小檗碱对照品为指标，对复方透骨香乳膏中的黄柏进行薄层鉴别研究；含量测定则采用高效液相色谱法以盐酸小檗碱为指标性成分对黄柏质量进行控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ThermoFisher Ultimate 3000(DAD)液相色谱仪；CAMAG薄层点样仪；AE 200型(十万分之一)电子天平(瑞士梅特勒托利多)、XP26型(百万分之一)电子天平(瑞士梅特勒托利多)；millipore超纯水机制备超纯水。

1.2 材料 复方透骨香乳膏(贵州健瑞安药业有限公司)，盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201212，含量以86.7%计)、黄柏对照药材(批号：121510-200501)均来自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄柏TLC鉴别 取本品内容物10 g，加甲醇40 mL，回流30 min，放冷，离心，取上清液，蒸干，加水20 mL溶解，加氨试液调pH值至11，加20 mL饱和氯化钠溶液，以二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷液，蒸干，加盐酸甲醇溶液(1∶100)2 mL溶解，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每l mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例称取除黄柏外其他药材适量，制成缺黄柏的阴性对照样品，同法制备缺黄柏的阴性对照溶液。照薄层色谱法(2015年版中国药典四部通则0502)试验，吸取供试品溶液5 μL，对照药材溶液2 μL，对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，正丁醇-冰乙酸-水(7∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且缺黄柏的阴性对照无干扰。如图1所示。

2.2 盐酸小檗碱HPLC含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Xbridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(30∶70)；检测波长：346 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min； 进样量：10 μL。理论塔板数按盐酸小檗碱峰计，应不低于4000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加盐酸-甲醇(1∶100)的混合溶液制成每1 mL含13 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物适量，混匀，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇(1∶100)的混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇(1∶100)的混合溶液补足减失的重量，置冰箱冷冻(-10 ℃)30 min，取出，摇散，立即过滤，精密吸取续滤液20 mL，蒸干，残渣用盐酸-甲醇(1∶100)的混合溶液4 mL洗至5 mL量瓶中，超声10 min，放冷，加盐酸-甲醇(1∶100)至刻度，置冰箱中冷冻10 min，取出，摇散，立即滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性供试品溶液的制备 取缺黄柏阴性样品，按2.2.3制备阴性供试品溶液，即得。

2.2.5 专属性考察 取盐酸小檗碱对照品溶液、复方透骨香乳膏供试品溶液及阴性供试品溶液各10 μL，按“2.2.1”色谱条件注入液相色谱仪，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰。如图2所示。

2.2.6 线性关系考察 精密取盐酸小檗碱对照品(13.439 μg/mL)2 μL、5 μL、10 μL，盐酸小檗碱对照品(26.877 μg/mL)10 μL、15 μL、20 μL依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，绘制工作曲线，得出线性回归方程为：y=42685.6257x-26.2489，r=0.9999，盐酸小檗碱在0.02688～0.5375 μg的范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验 精密吸取同一盐酸小檗碱对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱图峰面积，盐酸小檗碱对照品的峰面积RSD为0.08%，结果说明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批复方透骨香乳膏，按“2.2.3”供试品溶液制备方法制备6份，按“2.2.1”色谱条件测定盐酸小檗碱的含量，结果测得平均含量为0.0257 mg/g，RSD%为0.9%，表明方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验 取复方透骨香乳膏供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件，于0 h、2 h、8 h、12 h、18 h、24 h，测定峰面积，RSD%为1.2%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.10 回收率试验 取已测定含量的复方透骨香乳膏(平均含量0.0257 mg/g)2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(0.001292 mg/mL)50 mL，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，并按“2.2.1”色谱条件测定盐酸小檗碱的含量，计算回收率。结果见表1。

2.2.11 样品含量测定 取3批样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果见表2。

表1 回收率试验数据(n=6)

表2 样品测定结果 (n=2)

3 讨论

复方透骨香乳膏现行的标准对黄柏的质量控制只有盐酸小檗碱薄层鉴别，缺乏专属性，且供试品的制备方法可操作性和重现性较差，故本研究增加了黄柏对照药材对薄层鉴别进行质量控制，并对供试品的制备方法进行了研究，制得的供试品溶液提取率较高，有较好的分离效果。

盐酸小檗碱的含量测定研究中，取盐酸小檗碱对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描波长，在270 nm和346 nm出有较大吸收，经过试验摸索，以346 nm作为检测波长时可获得较高的灵敏度和良好的选择，故确定盐酸小檗碱的检测波长为346 nm。研究比较了不同流动相的洗脱效果，用乙腈-0.4%磷酸溶液(32∶68)[1]作为流动相时，盐酸小檗碱峰型不好，拖尾严重，流动相中加入少许离子对试剂十二烷基磺酸钠或缓冲盐试剂磷酸二氢钾[2]，可改善峰型并达到较好的分离效果，经试验摸索，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(30∶70)为流动相时可得到较好峰型与分离度，故确定乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(30∶70)为流动相。此外，复方透骨香乳膏供试品溶液中的乳状基质不易除尽，若供试品溶液中含有乳状基质会对高效液相色谱仪造成损坏，故本研究在最大效率提取盐酸小檗碱的同时，还考察了低极性有机溶剂脱脂[3]、离心[4]、冰浴[5]、冷冻等方法去除乳状基质，研究表明以冷冻法操作简便，效果较佳，可得到澄明的供试品溶液。

本实验对黄柏的TLC鉴别及盐酸小檗碱的含量测定的研究，方法可靠稳定，简便易行，可更加全面、可靠地控制复方透骨香乳膏中黄柏的质量，为其质量标准的提升制定提供可靠的依据。