聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白谷氨酰胺残基条件优化及其对蛋白抗原性的影响

罗舜菁 甘克明 陆旭丽 成娜娜 刘成梅

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)是乳清蛋白的主要成分，在乳清蛋白中的含量约为43.6～50.0%[1]。天然的β-LG也是牛乳中最主要的过敏原之一[2]，对牛乳过敏的患者中约82%的人会对β-LG产生过敏反应[3-4]。消除或降低牛乳致敏性的最有效方法是将过敏原物质从牛乳中分离，将牛乳中β-LG去除后可以模拟人乳，可用于婴幼儿配方奶粉的生产[5]。β-LG具有较高的营养价值及多种功能特性，如溶解性、起泡性和凝胶性等，因而在食品加工中具有较大的应用价值[6]，而其强致敏性使其应用范围受到了极大限制[2]。针对从牛乳中分离出的β-LG，为降低其致敏性，进行了大量的研究，其中，化学修饰技术如糖基化[7]、聚乙二醇修饰[8]等是目前研究的热点。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰多用于药物蛋白的修饰，以改善蛋白的生物化学特性、降低抗原性等[9]。分子量在1 000 Da以上的PEG无毒，且已被美国食品药品监督管理局批准用于食品、药品和化妆品中[8,10]。目前，应用PEG随机修饰来降低β-LG抗原性的研究[11-12]已有少量报道。然而，PEG随机修饰通常会得到多种PEG修饰产物的混合物，难以分离纯化和表征其性质[13]。此外，PEG随机修饰的修饰位点难以确定，使β-LG的修饰位点与抗原性间关系的研究存在较大困难。在随机修饰条件下，蛋白结构也会发生较大改变[8]。综上所述，应用PEG随机修饰难以对β-LG的抗原性变化机理进行深入探究，因而也难以对其抗原性进行有效调控。酶催化PEG定点修饰技术可在谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TG酶)的催化下，对蛋白质谷氨酰胺残基(Gln)进行定点修饰[14]，得到的修饰产物均一[15]，且修饰条件温和，因而对蛋白构象的影响较小。

本研究拟在TG酶催化下用5 kDa mPEG-NH2定点修饰β-LG的Gln残基，通过SDS-PAGE结合凝胶过滤色谱对修饰条件进行优化。经阳离子交换色谱对修饰产物进行分离纯化，用SDS-PAGE和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对修饰产物进行鉴定，通过间接竞争ELISA法对修饰前后的蛋白进行抗原性分析，以期开发有效降低β-LG 抗原性的方法，为进一步研究其抗原性变化机理提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

牛乳β-乳球蛋白、猪明胶：美国Sigma公司；

单甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)：5 kDa，北京键凯科技股份有限公司；

谷氨酰胺转氨酶(TG酶)：200 U/g，上海源叶生物科技有限公司；

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Glycine)、4×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)、考马斯亮蓝R250：北京索莱宝科技有限公司；

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、醋酸钠、氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、邻苯二胺、无水乙醇、冰醋酸、甲醇：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

三氟乙酸、乙腈：色谱纯，天津市大茂化学试剂厂；

吐温-20、30%过氧化氢、浓硫酸：分析纯，西陇科学股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

垂直电泳仪：Mini-PROTEIN Tetra型，美国伯乐公司；

中高压层析系统：NGC Quest 10 Plus型，美国伯乐公司；

酶标仪：HF2000型，北京华安麦科生物技术有限公司；

电子分析天平：ME104型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

pH计：Five Easy Plus型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

高速冷冻离心机：Heraeus Multifuge X1R型，美国Thermo公司；

数显恒温水浴锅：HH-2型，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；

超纯水系统：Simplicity UV型，美国Millipore公司；

高效液相色谱仪：Agilent 1100型，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 mPEG-NH2定点修饰β-LG谷氨酰胺残基 根据Mero等[9]的方法，修改如下：将β-LG溶解在一定pH值且含有一定量乙醇的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，使其浓度为1.0 mg/mL。依次按一定量β-LG与PEG摩尔比及TG酶与β-LG质量比(E/S)加入5 kDa的mPEG-NH2和TG酶，搅拌均匀后，在一定温度下反应12 h，用冰醋酸调pH至4.5终止反应。

1.2.2 单因素试验

(1) TG酶与β-LG质量比：按1.2.1方法，β-LG与PEG摩尔比1∶10，缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数)，反应pH 7.0，反应温度25 ℃，考察TG酶与β-LG质量比(5∶1，3∶1，1∶1，1∶3)对修饰率的影响。

(2) 反应pH：按1.2.1方法，TG酶与β-LG质量比1∶1，β-LG与PEG摩尔比1∶10，缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数)，反应温度25 ℃，考察反应pH(5.0，6.0，7.0，8.0)对修饰率的影响。

(3)β-LG与PEG摩尔比：按1.2.1方法，TG酶与β-LG质量比1∶1，反应pH 7.0，缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数)，反应温度25 ℃，考察β-LG与PEG摩尔比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20)对修饰率的影响。

(4) 缓冲液中乙醇添加量：按1.2.1方法，TG酶与β-LG质量比1∶1，β-LG与PEG摩尔比1∶10，反应pH 7.0，反应温度25 ℃，考察缓冲液中乙醇添加量(0%，15%，25%，35%)(体积分数)对修饰率的影响。

(5) 反应温度：按1.2.1方法，TG酶与β-LG质量比1∶1，β-LG与PEG摩尔比1∶10，反应pH 7.0，缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数)，考察反应温度(4，25，37 ℃)对修饰率的影响。

1.2.3 SDS-PAGE分析 参考Laemmli[16]的方法，用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行电泳。

1.2.4 凝胶过滤色谱分析 参考薛晓莹[17]的方法，不同反应条件下β-LG的PEG修饰产物的修饰率经Superdex 200凝胶色谱柱进行测定。按式(1)计算。

(1)

式中：

R——修饰产物的修饰率，%；

A1——β-LG的PEG修饰产物的峰面积，cm2；

A——总蛋白峰面积，cm2。

1.2.5β-LG的PEG修饰产物的纯化 参考Yu等[18]的方法并稍作改动，用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对修饰产物进行分离纯化。用pH 4.0，0.04 mol/L醋酸钠初始缓冲液(洗脱液A)和含1.0 mol/L NaCl的0.04 mol/L，pH 4.0醋酸钠缓冲液(洗脱液B)，以流速2 mL/min 进行梯度洗脱，洗脱梯度为0%～100%洗脱液B。在280 nm下测定各洗脱液的吸光值。收集各洗脱峰，经SDS-PAGE分析确定各洗脱峰的成分。然后收集PEG修饰产物的洗脱峰，用截留分子量10 kDa的Amicon Ultra-15超滤离心管于4 ℃下以4 990 r/min离心20 min，浓缩得到样品。

1.2.6 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析 参考李慧等[19]和玉莹等[20]的方法，用Waters SunFire C18色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)对β-LG及其修饰产物进行分析。

1.2.7 抗原性分析 参考蔡小飞等[1]和Kleber等[21]的方法，采用间接竞争ELISA法测定PEG修饰前后β-LG的抗原性。抗原性降低率按式(2)计算[1]。

(2)

式中：

P——抗原性降低率，%；

Ai——待测样品在490 nm处测得的吸光度；

A1——β-LG在490 nm处测得的吸光度；

A0——空白对照组在490 nm处测得的吸光度。

1.3 数据处理

采用Excel 2007进行数据整理，用Origin 8.0软件作图。所有数据为3次重复试验的平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 TG酶与β-LG质量比(E/S)及反应pH值对修饰率的影响 由图1(a)中泳道2～5可知，4种E/S下的反应液在电泳图中均只含有2个条带，分别在18，28 kDa附近，β-LG标准品的条带在18 kDa附近。因此，推测28 kDa 附近条带为其PEG修饰产物。比较28 kDa附近条带可知，随着E/S的增大，PEG修饰产物的量逐渐增加。修饰率测定结果如图1(b)所示，随着E/S的增大，其修饰率逐渐增大，在E/S为3∶1时达到最大。由于E/S增大时反应液中TG酶浓度增大，使酶与底物的接触面积增大，从而使修饰率增大；当E/S为3∶1时，酶浓度接近饱和，继续增大E/S其修饰率不再明显增加。

由图1(a)中泳道7～10可知，随着pH值的增大，PEG修饰产物的量呈先增大后减小的趋势，且在pH 6.0，7.0时均较大。修饰率测定结果与电泳结果一致，如图1(c) 所示，在pH 7.0时其修饰率最大，可能与TG酶的最适pH有关，在pH 6.0～7.0范围内其反应活性最强。

综上可知，5 kDa mPEG-NH2定点修饰β-LG的最佳TG酶与β-LG质量比为3∶1，最佳反应pH为7.0。

2.1.2β-LG与PEG摩尔比及乙醇添加量对修饰率的影响 由图2(a)、(b)可知，随着PEG添加量的增加，其修饰率呈先增大后减小的趋势，在β-LG与PEG摩尔比为1∶15 时最大。由于PEG添加量的增加使β-LG与PEG的接触面积增大，有利于修饰反应的进行；而当添加量过高时，反应液中过多的PEG会阻碍β-LG与TG酶的接触，从而使修饰率降低。

1. 蛋白Marker 2～5. 分别表示E/S为5∶1，3∶1，1∶1，1∶3时的反应液 6.β-LG 7～10. 分别表示pH为5.0，6.0，7.0，8.0时的反应液

图1 E/S及反应pH值对修饰率的影响

由图2(a)、(c)可知，随着乙醇添加量的增加，其修饰率呈先增大后减小的趋势，在乙醇添加量为25%时最大；而当乙醇添加量为35%时几乎无PEG修饰产物生成，生成大量沉淀，说明当乙醇添加量为35%时，缓冲液中乙醇浓度过高，使蛋白聚集沉淀，从而阻碍了反应的进行。

1. 蛋白Marker 2.β-LG 3～6. 分别表示β-LG与PEG摩尔比为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20时的反应液 7～10. 分别表示乙醇添加量(体积分数)为0%，15%，25%，35%时的反应液

图2 β-LG与PEG摩尔比及乙醇添加量对

Figure 2 Effects of molar ratio ofβ-LG to PEG and ethanol addition amount on modification rate

综上可知，5 kDa mPEG-NH2定点修饰β-LG的最佳β-LG与PEG摩尔比为1∶15，最佳乙醇添加量为25%(体积分数)。

2.1.3 反应温度对修饰率的影响 由图3(a)、(b)可知，反应温度对修饰反应的影响较大，在3个温度下PEG修饰产物的修饰率分别为14.08%，27.56%，4.36%，在25 ℃ 时其修饰率最高。因此，确定其最佳反应温度为25 ℃。

1. 蛋白Marker 2～4. 分别为4，25，37 ℃时的反应液 5. β-LG

图3 反应温度对修饰率的影响

综上可知，PEG定点修饰β-LG的最优条件为反应pH 7.0，反应温度25 ℃，β-LG与PEG摩尔比1∶15，TG酶与β-LG质量比3∶1，缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数)，该修饰条件下其PEG修饰产物的修饰率为60.17%。

2.2 β-LG的PEG修饰产物的纯化

如图4所示，经0.0～1.0 mol/L NaCl盐离子梯度洗脱后，反应混合液主要出现两个洗脱峰F1和F2。PEG与蛋白结合后会屏蔽蛋白表面的电荷，从而使蛋白与层析介质的结合强度减弱，因此PEG修饰产物会先于未修饰的蛋白而被洗脱下来[22]。据此推测，洗脱峰F1，F2分别为β-LG的PEG修饰产物和未修饰的β-LG。

分别收集两个洗脱峰经SDS-PAGE分析，由图5可知，洗脱峰F1在28 kDa左右有1个明显的条带，而洗脱峰F2在18 kDa左右有1个明显的条带，表明F1、F2两个洗脱峰分别对应β-LG的PEG修饰产物和未修饰的β-LG，与上述推测结果一致。此外，有研究[23]表明，在溶液中，PEG分子的每个乙氧基单元会与2～3个水分子结合，使PEG修饰产物的水化半径明显增大，因而PEG修饰产物的表观分子量通常是未修饰蛋白的分子量与2～3倍的PEG实际分子量之和。在图5中，β-LG的分子量在18 kDa左右，而其PEG修饰产物的分子量在28 kDa左右，刚好约为1个β-LG分子的分子量与2倍PEG分子量之和。据此推测，所得的产物为PEG单修饰产物，即1个PEG分子与1个β-LG分子结合。

图4 β-LG的PEG修饰混合物的阳离子交换色谱图

1. 蛋白Marker 2. 修饰混合物 3与5. 洗脱峰F1 4与6. 洗脱峰F2 7.β-LG

图5 阳离子交换色谱纯化得到的各洗脱峰SDS-PAGE图

Figure 5 SDS-PAGE analysis of elution peaks obtained by purification

2.3 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析

如图6所示，经乙腈和水梯度洗脱后，β-LG分别在31.3，32.7 min出现两个洗脱峰。牛乳中β-LG主要存在A、B两种遗传变异体，有研究[20,24]表明，通过RP-HPLC可将两种变异体分离开。因此，图6中β-LG的两个洗脱峰可能分别为其A、B两种遗传变异体。经阳离子交换色谱纯化得到的PEG修饰产物，其色谱峰无明显变化，除两种遗传变异体的洗脱峰外，无其他洗脱峰出现，表明在该修饰条件下PEG修饰位点固定，得到的修饰产物均一，无其他位置异构体生成。

图6 β-LG及其PEG修饰产物的反相高效液相色谱图

2.4 PEG修饰前后β-LG的抗原性变化

如图7所示，经PEG定点修饰后β-LG的抗原性显著降低，其降低率约为59.04%。由于在PEG修饰过程中添加了25%乙醇，为了探究25%乙醇是否会对β-LG的抗原性产生影响，以经25%乙醇处理过的β-LG为另一对照组对其抗原性进行测定，结果表明25%乙醇对β-LG的抗原性影响不大，其抗原性降低率仅为10.67%。上述试验结果表明，酶催化PEG定点修饰导致β-LG抗原性降低，其主要原因是连接在蛋白上的PEG链发挥了某种作用，而修饰条件对其抗原性影响不大。Mu等[25]研究表明，连接在蛋白上的PEG链能在蛋白表面形成一层独特的水化层，因而造成对蛋白的空间屏蔽作用。有研究[26-27]表明，β-LG的抗原性与线性表位和构象表位有关。肽段AA41～60，AA102～124，AA149～162是β-LG的主要抗原表位，分别能被92%，97%，89%的人血清识别[28]。因此，连接在β-LG分子上的大分子PEG链覆盖在蛋白表面，可能会掩盖表面的一些线性表位和构象表位，阻碍其与特异性抗体的结合，因而使β-LG的抗原性显著降低。

1. β-LG 2. 经25%乙醇处理过的β-LG 3. PEG修饰产物

Figure 7 Effect of site specific PEGylation at β-lactoglobulin glutamine residues on antigenicity

3 结论

本研究运用酶催化PEG定点修饰技术对β-LG的Gln残基进行定点修饰，通过SDS-PAGE结合凝胶过滤色谱分析确定最佳修饰条件为反应pH 7.0，反应温度25 ℃，β-LG与PEG摩尔比1∶15，TG酶与β-LG质量比3∶1，缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数)，在该修饰条件下其PEG修饰产物的修饰率为60.17%。最佳修饰条件下的修饰混合物经阳离子交换色谱纯化后，得到了均一的PEG单修饰产物。经PEG修饰后β-LG的抗原性显著降低，降低率可达59.04%。本试验仅对酶催化PEG定点修饰前后β-LG的抗原性变化情况进行了初步探究，后续可通过蛋白结构分析及PEG修饰位点分析等手段对其抗原性变化机理进行深入研究，为实现β-LG抗原性的有效调控打下基础。此外，酶催化PEG定点修饰对β-LG 的功能特性如乳化性、起泡性、凝胶性等的影响也有待研究。