醒脑静注射液对蛛网膜下腔出血大鼠学习记忆能力及海马区自噬相关蛋白表达的影响

李小亮，李林，陈扬，孙林林，李君，付爱军

(1华北理工大学，河北唐山063000；2开滦总医院林西医院；3华北理工大学附属医院；4郑州市第七人民医院)

动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)是严重威胁人类身体健康的急性脑血管疾病，其起病突然，症状变化多样，致死率、致残率高[1]。近年研究发现，自噬在SAH损伤机制中具有重要作用，一定程度上活化的自噬对SAH大鼠神经功能有积极作用[2]。醒脑静注射液是由传统中成药安宫牛黄丸演化而来并经过现代化工艺提纯的中药注射制剂，具有中枢神经保护作用，临床用于治疗缺血性脑血管、出血性脑血管病及颅脑损伤等疾病。醒脑静注射液可以通过血脑屏障起到清除氧自由基、减轻炎症反应的作用，但对SAH后自噬的研究较少。2017年12月～2018年11月，我们通过制作大鼠SAH模型，观察醒脑静注射液对大鼠海马区神经细胞中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表达的影响及其行为学变化，探讨醒脑静注射液脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠36只，2～3月龄，体质量(340±25)g，由华北理工大学曹妃甸学区临床医学院实验动物中心饲养。适应性喂养5 d，室温(23±2)℃，湿度50%±10%，自然光照，自主进食饮水。

1.1.2 药品、试剂与仪器 醒脑静注射液(10 mL/支，云南大理药业股份有限公司)，Beclin-1和LC3Ⅱ抗体(日本株式会社)，内参Tubulin(日本MBL公司)，免疫组化二抗及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。820-Ⅱ型切片机(德国Leica公司)，摄像显微镜(日本奥林巴斯公司)，震荡仪、电泳仪、电转槽、凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、醒脑静组，每组12只。采用颈动脉穿刺法制作SAH大鼠模型[3]。大鼠麻醉，仰卧并固定四肢及门齿，沿中线剪开皮肤，钝性分离皮下组织及颈部肌肉。游离颈部血管，结扎切断颈外动脉近心端的分支，远心端结扎颈外动脉并剪断，临时夹闭颈总动脉。颈外动脉残端剪口，穿入纤芯，牵连颈外动脉使纤芯沿颈内动脉进入颅内，自剪口处穿入约20 mm觉阻力，再穿入1～2 mm刺破血管，维持15 s退出纤芯。结扎颈外动脉，开放颈总动脉恢复血供，将伤口逐层缝合，正常饲养。假手术组只将纤芯沿血管穿入颅内，但不刺破血管，其他手术步骤与模型组相同。醒脑静组术后立即给予醒脑静注射液2 mL腹腔注射，1次/12 h；假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2 学习记忆能力观察 采用穿梭箱实验。大鼠自术前3 d开始进行穿梭箱训练，3次/d，以培养大鼠的条件反射。于腹腔注射药物后24 h行穿梭箱实验[4]，熟悉环境5 min，声光刺激5 s，接着电击20 s(1.5 mA)，完成一次实验。每次间隔20 s，共30次。记录大鼠的逃避反应时间和逃避反应次数。

1.2.3 海马神经细胞形态学观察 采用HE染色法。穿梭箱实验完成后，每组取6只大鼠麻醉、处死，灌注后冰上取脑。脑组织固定3 d，常规石蜡包埋，切片机以5 μm厚度冠状切取带海马CA1区的切片，一个蜡块取3张进行HE染色。显微镜下观察海马CA1区神经细胞形态。

1.2.4 海马神经细胞Beclin-1、LC3Ⅱ阳性表达检测 采用免疫组化法。取大鼠海马组织蜡块，5 μm厚度冠状切取带海马CA1区切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，加入3% H2O2孵育5 min，枸橼酸盐高压热修复120 s，PBS缓冲液洗3次。取3张切片滴加Beclin-1抗体(1∶100)，另取3张滴加LC3Ⅱ抗体(1∶100)，4 ℃过夜。滴加二抗，恒温箱37 ℃孵育30 min，PBS缓冲液洗3次。DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。光学显微镜下观察神经细胞，随机选取3个视野采集图片，Image Pro Plus6.0图像分析软件计数阳性神经细胞数量。

1.2.5 海马组织中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白检测 采用Western blotting法。穿梭箱实验完成后，每组取6只大鼠麻醉、处死，低温下取出海马，匀浆，加入RIPA裂解液，提取组织蛋白，BAC法测定蛋白浓度。电泳、转膜、抗原封闭，滴加Beclin-1一抗(1∶1 000)、LC3Ⅱ一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。洗膜，滴加二抗，再次洗膜后化学发光显影。以β-actin为内参，采用Quantity One软件对结果进行分析，计算Beclin-1、LC3Ⅱ的相对灰度值。

2 结果

2.1 三组学习记忆能力比较 与假手术组比较，模型组逃避反应时间延长、逃避反应次数减少(P均<0.05)；与模型组比较，醒脑静组逃避反应时间缩短、逃避反应次数增加(P均<0.05)。见表1。

表1 三组逃避反应时间和次数比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 三组海马神经细胞形态学比较 假手术组海马神经细胞多数形态正常；模型组胞核梭形固缩、深染情况明显增多，并有核破碎现象；醒脑静组与模型组比较，胞核梭形固缩、深染、核破碎情况明显减少。

2.3 三组海马神经细胞Beclin-1、LC3Ⅱ阳性表达情况比较 与假手术组比较，模型组Beclin-1、LC3Ⅱ阳性神经细胞数均增加；与模型组比较，醒脑静组Beclin-1、LC3Ⅱ阳性神经细胞数均增加(P均<0.05)。见表2。

表2 三组海马神经细胞Beclin-1、LC3Ⅱ阳性表达数比较(个

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.4 三组海马组织中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组海马组织中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P均<0.05)；与模型组比较，醒脑静组海马组织中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P均<0.05)。见表3。

表3 三组海马组织中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

醒脑静注射液是由麝香、栀子、郁金、冰片等中药经过现代化工艺提纯而成。麝香气味芳香，具有通经络、开窍醒神的功效，可增强神经细胞对氧供不足的适应力，刺激神经细胞，加快意识清醒；栀子清热解毒、芳香开窍、止痛，能够增强脑组织对缺氧的耐受力；郁金味苦性寒，具有祛痰开郁通窍的功效；冰片辛香走窜，可通诸窍，增强麝香对神经细胞的兴奋作用[5]。诸药合用，共同发挥清热泻火、凉血解毒、开窍醒脑之功效，临床广泛用于治疗颅脑创伤、脑梗死、高血压脑出血、蛛网膜下腔出血等多种神经系统疾病[6～10]。现代药理学研究认为，醒脑静注射液的神经保护作用机制包括：①降低血清可溶性血管细胞黏附分子1(sVCAM-1)、TNF-α、IL-18等细胞因子的表达水平，从而有效保护中枢神经细胞；②抑制炎症反应，降低超敏C反应蛋白表达，起到一定的神经保护作用；③通过调节Keap1-Nrf2/ARE氧化应激通路，增强细胞对氧化损伤的耐受程度，进而保护神经细胞，维持正常的神经功能；④降低组织细胞丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，从而拮抗氧自由基，保护神经细胞[11～14]。HE染色可见，模型组海马神经细胞死亡数量较多，醒脑静组海马死亡神经细胞数量较模型组减少。这表明SAH可以损伤海马神经细胞，导致其死亡;醒脑静注射液可以减轻SAH对海马神经细胞的损伤，稳定神经细胞的结构和功能。穿梭箱实验结果显示，与假手术组比较，模型组逃避反应时间延长，逃避反应次数减少；与模型组比较，醒脑静组逃避反应时间缩短，逃避反应次数增加。这表明SAH大鼠学习记忆能力下降，醒脑静注射液可以改善SAH大鼠的学习记忆能力，发挥保护神经功能的作用。

自噬是保持细胞自身内环境稳定的一种细胞内溶酶体蛋白降解途径[15]。通过自噬能够降解损伤的细胞器和有害物质，并可以为蛋白质的合成和细胞器的更新供给相应的原料，从而维持细胞功能[16]。有学者指出，脑细胞受到有害刺激后存在自噬的发生，并且通过实验发现适度增强的自噬能够降低脑细胞死亡率，对脑功能起保护作用[17，18]。研究显示，SAH后脑细胞发生的自噬在24 h达高峰[19]。本研究结果显示，SAH造模后24 h时，模型组海马组织中Beclin-1、LC3Ⅱ阳性神经细胞数目及Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达较假手术组升高，而醒脑静组高于模型组，表明醒脑静可以增强SAH大鼠神经细胞自噬。

综上所述，醒脑静注射液可以改善SAH大鼠的神经功能，提高其学习记忆能力，该机制可能与增强SAH大鼠海马区神经细胞自噬有关。本研究可为醒脑静注射液用于SAH患者的临床治疗提供基础理论支持。