扶芳藤总黄酮提取条件及其对衰老小鼠血清和心肌组织CAT、T-AOC、GSH-Px活性的影响

张明，温奇龙，汪琴，蔡丹昭

(广西医科大学，南宁 530021)

衰老是分子、细胞、器官功能乃至整个机体持续性积累各种功能损伤的综合复杂的生理、病理变化过程[1]，是糖尿病、高血压、高血脂以及心脑血管疾病和一些神经功能性退化疾病如阿尔茨海默病等疾病的独立危险因素。对衰老及衰老相关疾病的研究一直是生命科学领域最为重要的问题之一。近年来各国学者在抗衰老的研究中相继提出200多种衰老学说，其中公认的有自由基学说、代谢学说和免疫系统退化学说等[2，3]。研究显示，扶芳藤提取物具有抗氧化、清除自由基、抗菌、降压等生物学活性[4]，提示扶芳藤提取物可能通过提高抗氧化能力起到抗衰老作用。本课题组的前期研究发现，扶芳藤提取物的主要成分为黄酮类化合物，但在扶芳藤总黄酮的提取和功效研究方面报道较少。2017年3月～2018年6月，我们通过比较实验室不同条件下扶芳藤醇提物总黄酮的提取率，筛选最适提取条件；建立D-半乳糖衰老小鼠模型，观察扶芳藤总黄酮提取物对小鼠血清及心肌组织中抗氧化指标[过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]的影响，旨在评价扶芳藤总黄酮抗衰老的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与药品 清洁级健康雄性昆明小鼠50只，6～8周龄，体质量18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供。常温环境、昼夜各12 h、常规饲料喂养，自由饮食，适应性喂养1周后用于实验。扶芳藤干燥粉末由广西中医药大学制药厂提供，芦丁对照品购自中国食品药品检定研究院。

1.1.2 试剂与仪器 D-半乳糖(Solarbio公司)，GSH-Px、CAT、T-AOC检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所)，大孔树脂(30266071、国药集团化学试剂有限公司)，无水乙醇、乙酸乙酯、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为国产分析纯，羟甲基纤维素钠为国产化学纯。紫外可见分光光度计(美国BioTek公司)、旋转蒸发仪(杭州亿捷科技有限公司)、防腐台式循环水真空泵(巩义市科瑞仪器有限公司)、台式高速大容量离心机(Eppendorf公司)、电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 扶芳藤总黄酮的提取、分离和纯化

1.2.1 总黄酮样品最佳测定波长的确定[5]精密称量芦丁对照品5.00 mg，配制成0.25 mg/mL的标准溶液；精确吸取标准溶液1 mL，加入10 mL容量瓶中，再加入2 mL AlCl3溶液，混匀后静置6 min；精确加入3 mL NaAc缓冲液，混匀静置显色15 min；加入60%乙醇溶液定容，上下颠倒容量瓶混匀。采用同样方法配制总黄酮样品溶液。以60%乙醇溶液作为空白对照，用紫外可见分光光度计在波长480～520 nm处进行扫描。结果显示，芦丁标准溶液和总黄酮样品溶液在510 nm处的吸光度值最高，故选择510 nm作为总黄酮样品溶液的测定波长。

1.2.2 标准曲线绘制[6]精确称取芦丁对照品5 mg，加入60%乙醇溶液配制成0.1 mg/mL的标准溶液。精确吸取芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入60%乙醇至5 mL。再分别加入5%质量分数的NaNO2溶液0.50 mL，摇匀，室温放置6 min；加入10%质量分数的AlNO3溶液0.50 mL摇匀，室温放置6 min；加4%质量分数的NaOH溶液4.00 mL摇匀，室温放置15 min。用紫外可见分光光度计在510 nm波长处测定吸光度。以60%乙醇溶液作为参照，以吸光度为纵坐标、芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线得到回归方程y=13.243x-0.014 2，R2=0.998 1。

1.2.3 扶芳藤总黄酮提取最适条件的确定 以扶芳藤总黄酮提取率为考察目标，选定提取温度(A)、提取物料比(B)、提取时间(C)3个因素，每个因素分别对应设计3个水平作L9(33)正交实验，筛选出扶芳藤总黄酮提取的最适提取条件。正交试验的因素和水平见表1。

表1 正交试验的因素与水平

注：A为提取温度，B为提取物料比，C为提取时间。

1.2.4 扶芳藤总黄酮的提取 取170 g扶芳藤粉末，加入60%乙醇溶液充分溶解，置于超声波辅助提取罐中，按设定的超声功率、时间、温度进行提取。滤液减压抽滤除滤渣，用旋转蒸发仪低温回收乙醇，再用乙酸乙酯萃取3次，萃取液挥干乙酸乙酯后用95%乙醇溶解，大孔树脂[7]95%乙醇浸泡48 h后装柱加样。以1体积35%乙醇洗脱杂质，2体积75%乙醇洗脱后，收集黄酮，再用95%乙醇洗柱。将75%乙醇收集到的液体回流挥干、用60%乙醇定容至100 mL，显色，测定吸光度值。将测得的吸光度代入回归方程，计算总黄酮浓度，以总黄酮浓度×样本稀释倍数×加入乙醇提取液的体积/粉末样品质量计算总黄酮含量[8]。

1.3 扶芳藤总黄酮对衰老小鼠血清和心肌组织中抗氧化指标影响的观察

1.3.1 动物分组与模型建立 将小鼠随机分为正常组、模型组和扶芳藤总黄酮低、中、高剂量组，每组各10只。模型组和扶芳藤总黄酮组按0.2 mL/d给予颈背部皮下注射5% D-半乳糖诱导衰老模型，正常组以等量生理盐水注射，连续1周。

1.3.2 给药干预与标本采集 从第3周开始，扶芳藤高、中、低剂量组分别给予0.2、0.4、0.8 g/mL的扶芳藤总黄酮提取液0.3 mL/d灌胃，正常对照组和模型组等量蒸馏水灌胃，连续4周。最后一次给药后，禁食不禁水12 h，75%乙醇消毒后，摘取小鼠一侧眼球取血液，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液4 ℃冰箱保存待测。取血后小鼠颈椎脱臼处死，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，去除脂肪、系膜，冰上匀浆后加入生理盐水配成10%组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液-20 ℃保存。

1.3.3 血清及心肌组织中CAT、T-AOC、GSH-Px检测 采用酶法检测CAT、T-AOC、GSH-Px活性，严格按照试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 扶芳藤总黄酮的最适提取条件 正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。通过正交实验9组试验条件的比较，经正交试验方差分析，极差大小排序为A>B>C，表明影响扶芳藤总黄酮提取率的三个因素主次顺序为提取温度>提取物料比>提取时间。确定扶芳藤总黄酮提取的最适条件为温度60 ℃、料液比1∶50、时间30 min。在此试验条件下进行提取得到总黄酮提取率为3.57%，优于其他试验条件(P均<0.01)。

表2 超声波辅助法提取正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

2.2 扶芳藤总黄酮提取结果 按正交实验最佳提取条件进行扶芳藤总黄酮提取，最终得到浓度为0.8 g/mL、纯度68.7%的扶芳藤总黄酮提取物。

2.3 扶芳藤总黄酮对衰老小鼠血清及心肌组织中T-AOC、CAT、GSH-Px活性的影响 见表4、5。

表4 各组血清T-AOC、CAT、GSH-Px活性比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

表5 各组心肌组织T-AOC、CAT、GSH-Px活性比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂，具备较强的清除自由基和抗氧化能力，具有清热解毒、抗肿瘤、抗氧化及抗炎镇痛等药理活性[9，10]。目前对黄酮类化合物的提取方法包括热水提取法、醇提取法、碱提酸沉法、超临界CO2萃取等[11]。与传统的分离纯化方法相比较，超声波辅助提取可破坏植物细胞，加速黄酮的扩散和溶解，有效提高黄酮的提取率，广泛用于提取植物中的黄酮等活性成分。大孔树脂吸附分离技术提取分离中药有效成分有明显优势，对苷类、黄酮、萜类、生物碱、内脂、有机酸等的分离纯化效果较好。有关总黄酮的含量测定方法主要是紫外分光光度法。本研究以芦丁为对照品，采用AlNO3比色法测定总黄酮含量。然后采用超声波辅助提取-D101大孔树脂-乙酸乙酯萃取为分离纯化方法，正交试验设计并最终确定了实验室扶芳藤总黄酮提取的最适条件为温度60 ℃、料液比1∶50、时间30 min，在此条件下提取的扶芳藤总黄酮提取率为3.57%。

既往中药粗提物研究发现，扶芳藤粗提物具有一定的抗衰老作用，扶芳藤水提物对家兔心肌缺血再灌注损伤有抑制作用[12]；扶芳藤提取物可提高急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠机体免疫能力，有止血及镇痛作用[13]。但是，其具体的抗衰老机制尚不明确。衰老自由基学说认为，机体在生理情况下不断产生自由基的同时，也被体内抗氧化系统所清除，随着年龄的增长，抗氧化系统失去平衡，导致自由基过剩，引起不同程度的细胞毒性及瞬时的不可逆损伤，进而加速机体的衰老和死亡[14，15]。

D-半乳糖所致的衰老模型是目前国内公认的衰老动物模型，大剂量D-半乳糖在醛糖还原酶的催化下被还原成半乳糖醇，半乳糖醇无法被细胞进一步代谢，在细胞内大量堆积，影响正常渗透压，导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱，同时产生大量超氧自由基，氧化应激引起机体细胞功能损伤及抗氧化酶活性下降，导致衰老[16]。GSH-Px是机体中重要的抗氧化酶，是自由基清除系统的重要组成成分[17]；T-AOC可反映机体总的抗氧化能力，其水平下降表明机体整体抗氧化能力降低[18]；CAT是催化过氧化氢分解为氧和水的酶，是机体内过氧化氢酶体的标志酶。研究结果显示，模型组小鼠血清、心肌组织中CAT、T-AOC、GSH-Px活性下降，扶芳藤总黄酮组抗氧化活性升高，且高剂量组各指标高于中、低剂量组。这表明扶芳藤总黄酮具有一定的抗氧化性，可提高小鼠的机体免疫能力，延缓衰老。本研究为进一步开发扶芳藤的抗衰老作用机制提供了理论基础，为抗衰老新药的开发提供了依据。