高效液相色谱法测定马西替坦中N,N-二甲基苯胺含量

程蕤，姜辉，周晶，李霁明，汪琛媛

(安徽中医药大学第一附属医院，a 药学部，b 科研科，合肥 230031)

肺动脉高压(PAH)是由已知或未知原因引起肺动脉压力异常升高的疾病，最终导致右心心力衰竭甚至死亡，平均生存期仅为2.8年[1]。PAH的治疗一直是医学界的挑战，除常规治疗和钙通道阻滞剂治疗外，靶向治疗如内皮素受体拮抗剂、前列环素及其类似物等在动脉型PAH的治疗中发挥了重要的作用[2-3]。

马西替坦是一种口服的双重内皮素受体(ETA和ETB)拮抗剂，临床用于PAH的治疗，与已经上市的波生坦相比，马西替坦有更好的组织分布，与内皮素受体亲和性更高，且药物相互作用少，药物耐受性和安全性都令人满意，成为广受关注的PAH治疗新药物，目前马西替坦及其片剂在国内尚未上市[4-5]。N,N-二甲基苯胺是合成马西替坦用的一种原料，鉴于其有一定的毒性，为保证药品的安全，需要对马西替坦中N,N-二甲基苯胺含量进行控制。目前，在药物分析领域常用的色谱法主要有气相色谱法、高效液相色谱法和色谱联用技术[6]，国内对N,N-二甲基苯胺的分析方法还没有统一标准。已有研究表明，采用气相色谱法可以定量测定水中的N,N-二甲基苯胺含量[7-9]，采用液相色谱-质谱联用可以检测药品中痕量N,N-二甲基苯胺的含量[10-11]，而直接用液相色谱分析法来测定N,N-二甲基苯胺的含量，鲜有报道。与气相色谱法相比，液相色谱法具有定量准确性更好、重复性更好和液相的流动相变化更灵活等优点。本组于2014年3月建立了高效液相色谱法测定马西替坦中的N,N-二甲基苯胺的含量，探讨其有效性。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪(美国科学仪器公司SSI 500 DETECTOR Dual Wavelength US/Vis，SSI Series Ⅲ 泵，Anastar色谱工作站)；电子分析天平(瑞士梅特勒公司，型号：AB135-S)；紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，型号：TU1810)；超声波清洗器(广州市科洁盟实验仪器有限公司，型号：KM-615B)。

1.2 试剂 N,N-二甲基苯胺对照品(北京百灵威科技有限公司，批号：L290N30)；马西替坦(合肥久诺医药科技有限公司，批号：1403010、1405010、1405011、1405012)，甲醇、乙腈为色谱纯；水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：菲罗门 Luna C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(20∶80)；流速：1.0 mL/min；检测波长254 nm，柱温30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 流动相的选择 参照文献[9]“液相色谱法测定水中痕量N,N-二甲基苯胺”中流动相与检测波长，并在此基础上，进行流动相筛选及优化，确定最终流动相为水(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(20∶80)。

2.3 检测波长的选择 取N,N-二甲基苯胺适量，精密称定，用流动相定量稀释制成每1毫升中约含10 μg的溶液，参照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版四部通则0401)，在200～400 nm波长范围内扫描，见图1。结果显示，N,N-二甲基苯胺在254 nm波长处有最大吸收，与参考文献[9]一致，故选择254 nm作为检测波长。

图1 N,N-二甲基苯胺紫外扫描图

2.4 溶液的制备

2.4.1 对照品溶液的制备 取N,N-二甲基苯胺对照品适量，精密称定，用流动相定量稀释制成1 mL中约含0.5 μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。见图2，3。

2.4.2 供试品溶液的制备 取马西替坦约20 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释制成每1毫升中含1 mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。见图4。

图2 空白溶剂图

图3 对照品溶液高效液相色谱图

图4 供试品溶液高效液相色谱图

2.5 线性试验 取N,N-二甲基苯胺对照品适量，精密称定，用流动相定量稀释制成1 mL中约含0.75 mg的溶液，摇匀，精密量取1 mL至50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取贮备液0.2、2、3、4、5、6 mL，分别置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下的色谱条件，分别进样20 μL，记录色谱图。以N,N-二甲基苯胺峰面积(A)对浓度(C，μg/mL)进行线性回归，得回归方程A=24812C-105.6，相关系数r=0.9995(n=5)。结果表明，浓度在0.031～0.937 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密量取线性试验项下浓度为0.625 μg/mL的溶液，按“2.1”项下的色谱条件，重复进样6次，记录主峰面积，算得主峰面积的RSD为0.46%，说明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取马西替坦(批号：1403010)，按“2.4”项下方法配制供试品溶液6份，按“2.1”项下的色谱条件依次测定。结果按外标法计算的平均含量为24.5 ppm，RSD为1.58%。说明本方法重复性好。

2.8 定量限 取线性试验项下浓度为0.625 μg/mL的溶液，用流动相逐级稀释成系列浓度的溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，以信噪比S/N=10计算定量限，测得N,N-二甲基苯胺定量限为0.4 ng。

2.9 溶液稳定性 按“2.4”项下方法配制供试品溶液，室温放置，在0、1、2、4、8、12、24h时，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录主峰面积，得主峰面积RSD为0.73%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 回收率试验 取N,N-二甲基苯胺对照品适量，精密称定，用流动相稀释制成每1毫升中含3 μg的溶液，作为对照品贮备液。取马西替坦(批号：1403010)约20 mg，精密称定，共9份，分别置20 mL量瓶中，再分别加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL的上述对照品贮备液，并用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另按“2.4”项下方法配制对照品溶液。按“2.1”项下的色谱条件测定，按外标法计算回收率。结果N,N-二甲基苯胺的平均回收率为99.58%，RSD为1.22%(n=9)，具体结果见表1。

表1 N,N-二甲基苯胺回收率测定结果

2.11 耐用性试验 参照中国药典2015年版四部[12]要求，微调分析条件，按“2.4”项下方法配制供试品溶液，在不同的色谱条件下进样，以分离度为主要考察指标，考察方法的耐用性，结果柱温、流速、流动相比例、pH值等进行微小调整，分离度均符合要求，表明本方法的耐用性较好。见表2。

表2 高效液相色谱法耐用性测定结果

2.12 样品测定及含量限度的确定 按照建立的方法测定3批马西替坦样品，按外标法计算N,N-二甲基苯胺含量(批号：1405010为0.0182‰,批号：1405011为0.0211‰，批号：1405012为0.0159‰)。根据试验研究结果并参考中国药典2015年版四部[12]残留溶剂的相关规定，同时考虑不同批次间的差异，将马西替坦中N,N-二甲基苯胺限度规定为不得过50×10-6。

3 讨论

马西替坦属孤儿药，虽然有报道对马西替坦有关物质进行过测定[13]，但目前关于马西替坦中N,N-二甲基苯胺含量测定鲜有文献报道。N,N-二甲基苯胺是合成马西替坦用的一种试剂，鉴于其有一定的毒性，为保证药品的安全，通过对马西替坦中N,N-二甲基苯胺含量测定，可以控制马西替坦中N,N-二甲基苯胺含量，同时为化学药品中N,N-二甲基苯胺的含量测定色谱法的选择提供参考。

笔者曾试图通过气相色谱法检测马西替坦中N,N-二甲基苯胺含量，但经对色谱柱、载气及柱温等条件筛选后发现在保证N,N-二甲基苯胺与马西替坦及各杂质达到基线分离的情况下色谱保留时间均大于45 min，检测效率低。因此，改用液相色谱法，经对检测波长、流动相组成及比例的优化筛选，根据分离度、柱效及色谱保留时间最终采用水-乙腈体系，以磷酸调节pH值改善峰形，N,N-二甲基苯胺与马西替坦及各杂质分离良好，色谱保留时间在20 min内。

国内有很多文献报道高效液相色谱法适合一些化学药物有关物质含量检测[14-16]。本课题采用高效液相色谱法测定马西替坦中N,N-二甲基苯胺的含量，通过方法学研究，包括线性试验、精密度试验、重复性试验、溶液稳定性试验、回收率试验以及耐用性试验等，结果均符合要求，适合马西替坦中N,N-二甲基苯胺的检测。