双缩脲法测定胶原贴敷料中Ⅰ型胶原蛋白含量

程娟 刘雯恩 黄敏菊 党玺芸 周艳芳 ＊ 彭新生 ＊

1 广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510663）

2 广东医科大学药学院 （广东 东莞 523808）

内容提要： 目的：探讨采用双缩脲法测定Ⅰ型胶原蛋白含量。方法：应用双缩脲试剂对Ⅰ型胶原蛋白样品进行双缩脲反应，形成紫色络合物，选取恰当波长测定其吸光度，通过标曲计算胶原蛋白含量。结果：选取540nm为测定波长；Ⅰ型胶原蛋白标准溶液在0.01～6.55mg/g范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y=0.0408x+0.0016（r2=0.9983）；其中精密度、稳定性和重复性试验结果的相对标准偏差（RSD）分别为0.45%、2.79%和2.73%；平均回收率98.72%；3份胶原蛋白贴敷料样品中Ⅰ型胶原蛋白含量1.23mg/g、1.46mg/g、1.21mg/g。结论：双缩脲法测定胶原蛋白含量具有灵敏度高，重现性好，测量精确等特点，适宜于贴敷料中Ⅰ型胶原蛋白含量测定。

胶原蛋白存在于生物体所有组织中，是一种具有独特的三螺旋结构的重要的功能性蛋白，其具有良好的生物相容性，低免疫源性，对人体具有保护功能和信号转导、生长因子和细胞因子转运等功能，已经广泛应用于医药、食品、化工等领域[1,2]。Ⅰ型胶原蛋白是皮肤的主要成分，约占真皮层干重的85%～90%，具有营养性、保湿型、修复性、亲和性、美白和配伍性等功效，广泛应用于皮肤修复和化妆品行业[3]。已有多家生产企业进行Ⅰ型胶原蛋白贴敷料医疗器械的研发申报。胶原贴敷料主要成分为Ⅰ型胶原蛋白，在临床上可用于皮肤过敏、激光、光子术后创面修复辅助治疗，对面部痤疮、色素沉积等也有一定的改善作用。胶原蛋白的含量是表征胶原蛋白产品贴敷料质量的重要指标之一。广东省DB44/T 1360-2014地方标准明确规定敷料的胶原蛋白含量不小于1.0mg/mL。经研究发现，双缩脲法测定Ⅰ型胶原蛋白含量，测定方法经济，简便，测定结果准确，重现性好。

1.材料与方法

1.1 一般材料

仪器：UV-6000 PC紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；BCD-539WT冰箱（青岛海尔股份有限公司）；FBZ1002-VP标准试剂型超纯水（青岛富勒姆科技有限公司）；QT-2涡旋混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；SOP电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

试剂：Ⅰ型胶原蛋白标准品（浙江崇山生物制品有限公司）；Ⅰ型胶原蛋白贴敷料（浙江崇山生物制品有限公司）；冰醋酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠（天津市大茂化学试剂厂，批号：20180502、20180201、20160111，分析纯）；硫酸铜（天津市百世化工有限公司，批号：20130114，分析纯）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备

①双缩脲试剂：称取1.50g硫酸铜、6.0g酒石酸钾钠，用500mL纯化水溶解，在搅拌下加入300mL 10%NaOH溶液，用纯化水稀释至1000mL摇均匀，即得。②待测供试液和空白溶液的制备：分别精密量取1.0mL Ⅰ型胶原蛋白贴敷料液、Ⅰ型胶原蛋白标准品溶液和纯化水各1mL至5mL容量瓶中，加双缩脲试剂4mL，自动涡旋混合器充分均匀后，室温放置30min，即得待测供试液。

1.2.2 测定波长选择

取“1.2.1”待测供试液，测定前需用空白溶液调零，于分光光度仪于400～700nm波长处扫描，选取适宜的测定波长。

1.2.3 标准曲线方程的建立

精密称取Ⅰ型胶原蛋白标准品，用0.5mol/L乙酸配置浓度为6.55mg/mL的储备液，分别精密称取此储备液0.0108g、0.1209g、0.2045g、0.3004g、0.4018g、0.5159g、0.6207g、0.7112g、0.8409g、0.9300g、1.0315g、2.0345g、3.0405g、4.3019g、5.0525g、7.0772g、8.0121g、9.2134g于10mL容量瓶中用0.5mol/L乙酸，自动涡旋混合器充分摇匀，即得不同浓度的胶原蛋白标准溶液。精密量取标准溶液1.0mL于5mL容量瓶中，按“1.2.1”项下操作，加双缩脲试剂4mL，涡旋混匀，室温放置30min；空白溶液调零，测定吸光度。以吸光度为纵坐标（y），浓度（mg/g）为横坐标（x），绘制标准曲线，建立标准曲线回归方程。

1.2.4 精密度试验

取“1.2.1”项中Ⅰ型胶原蛋白标准品溶液，在选取的波长处连续测量6次，并记录相对应波长处的吸光度值。

1.2.5 稳定性试验

取“1.2.1”项中Ⅰ型胶原蛋白标准品溶液，在选取的波长处分别于0、1、3、5、7、9h测定吸光度值。

1.2.6 重复性试验

平行精密量取6份Ⅰ型胶原蛋白标准品溶液，在选取的波长处测定吸光度值。

1.2.7 回收率试验

取已知质量分数的样品Ⅰ型胶原蛋白贴敷料供试液9份，分3组，每组为3份，分别按样品含量的80%、100%、120%加入Ⅰ型胶原蛋白标准品溶液，混合均匀后，按1.2.1项下操作，分别加入4mL双缩脲试剂，涡旋混合器充分均匀后，室温放置30min。空白校正，在选取的波长处测定吸光度并计算回收率。

1.2.8 Ⅰ型胶原蛋白贴敷料中蛋白含量测定

精密量取3份Ⅰ型胶原蛋白贴敷料样品1mL于5mL容量瓶中，按1.2.1项下操作，分别加入4mL双缩脲试剂，涡旋混合器充分均匀，室温放置30min。空白校正，在选取的波长处测定吸光度，计算Ⅰ型胶原蛋白含量。

2.结果

2.1 测定波长的选择结果

Ⅰ型胶原蛋白标准溶液、Ⅰ型胶原蛋白贴敷料供试液均在540nm处有最大吸收，空白样品溶液在此波长处无吸收，因此选择540nm为测定波长，见图1。

2.2 曲线方程建立结果

线性方程为Y=0.0408x+0.0016（r2=0.9983），Ⅰ型胶原蛋白标准品溶液在0.007～6.55mg/g范围内呈良好的线性关系。见表1。

2.3 精密度、稳定性和重复性试验结果

540nm处测定Ⅰ型胶原蛋白的标准品溶液吸光度分为别0.0979、0.0981、0.0980、0.0981、0.0970、0.0975，精密度试验（RSD=0.45%，n=6）；540nm处测定于0、1、3、5、7、9h测定Ⅰ型胶原蛋白的标准品溶液吸光度值0.0979、0.1017、0.1030、0.0954、0.0986、0.0997（RSD=2.79%，n=6）， 样品在9h内比较稳定；重复性实验中测定的吸光度为0.1040、0.1030、0.0990、0.1036、0.0988、0.0981（RSD=2.73%，n=6）；精密度、稳定性和重复性试验结果均符合要求。

图1. 紫外扫描图（注：A为Ⅰ型胶原蛋白标准溶液；B为Ⅰ型胶原蛋白贴敷料供试液；C为空白溶液）

表1. Ⅰ型胶原蛋白标准品溶液在540nm处吸光度其对应的浓度大小

2.4 回收率试验结果

平均回收率为98.72%，见表2。

表3. 胶原贴敷料中Ⅰ型胶原蛋白含量测定结果(n=3)

2.5 胶原蛋白含量测定结果

胶原贴敷料中Ⅰ型胶原蛋白含量测定结果，见表3。

3.讨论

目前，胶原蛋白含量没有特异性的检测方法，其测定方法包括凯氏定氮法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford），双缩脲法（Biuret）[4]。国家标准大部分使用凯氏定氮法。不同来源的胶原蛋白，其凯氏定氮法换算系数也不相同，并且凯氏定氮法操作复杂，时间长，试剂消耗大，实验过程的高温和产生毒气[4]。紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford）仅适用于微量蛋白质的含量测定[5]。Ⅰ型胶原蛋白溶液在235nm处有较大的吸收峰，但用此波长测定含量时容易受其他物质的干扰[1,6]。文献报道证实，双缩脲法检测血清蛋白含量是具有操作方便、快速、准确的特点[7]。经研究证实，双缩脲法适用于I型胶原蛋白的含量测定，该法方便快速、重现性好、测量精确。

表2. 回收率试验结果