李种质资源ISSR反应体系引物筛选

安佰义 王迦 王嫚 于慧颖 范爱淇 张艳波 张艳 李锋

摘要：以李18个品种种质资源为试验材料，对其开展ISSR反应体系引物筛选，结果表明，从41个随机引物中筛选出25个多态性引物用于PCR扩增，每个多态性引物擴增出的条带数在8～23条之间，扩增出的DNA片段长度大多在150～2 400 bp 之间;共扩增出条带数为385条，其中，样品间相同的条带数有53条;所选引物的多态位点百分率为86.23%。

关键词：李;种质资源;ISSR;引物;多态位点

中图分类号： S662.302.4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0063-03

区间简单重复序列标记（inter-simple sequence repeat，ISSR）是一种微卫星基础上的第2代分子标记技术，其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，在简单重复序列（SSR）的3′端或5′端各加2～4个非重复随机核苷酸序列作为引物，在聚合酶链式反应（PCR）中锚定引物可引起特定位点退火，并对重复序列间的DNA片段进行PCR扩增[1-3]。ISSR标记结合了随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、SSR技术的优点，具有模板DNA用量少、引物设计简单、成本低、PCR扩增产物多态性丰富、产物重复性和稳定性好、试验安全性较高及技术难度较低等特点[4]，现已在植物遗传作图、基因定位、品种鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析等方面被广泛应用[5-9]。

我国是李的起源地之一，有着非常丰富的李种质资源，是李种质遗传多样性中心[10]。李是优良的蜜源植物，其叶簇、花朵、果实有一定的观赏价值，可作庭园绿化树种[11]。中国李对土壤要求不严格，适应性好，生长迅速，结实期早，产量高，抗灰腐病力强，果实耐贮藏，被世界各国引种栽培，并作为培育李的重要亲本，而在长期选育过程中，李的亲缘关系复杂[12]。本试验对李种质资源基因组进行ISSR-PCR扩增，以期筛选出扩增良好的引物，对李种质资源亲缘关系的鉴定及研究能提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

18份李种质资源，由国家果树种质公主岭寒地果树资源圃提供，试验编号及种质名称见表1。试验引物共41个（表2），参照哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 植物基因组DNA的提取

采用十二烷基苯磺酸钠（SDS）法提取植物基因组DNA。2016年5月，自李树刚萌发的新梢上采集幼嫩叶片 液氮速冻，置于-80 ℃冰箱中保存，备用;取适量叶片，液氮条件下研磨至粉末状，装于2 mL离心管，加入Buffer A提取液，立即混匀;65 ℃水浴16 min，其间摇动离心管2次;取出离心管，冷却至室温，加入体积比为25 ∶ 24 ∶ 1的酚、三氯甲烷、异戊醇混合液800 μL，轻轻摇匀2～3 min;12 000 r/min离心 8 min，上清转移至1.5 mL离心管中，尽量不要触动中间蛋白层;加入 0.7 倍体积的异丙醇至上清液中，轻轻混匀，直至絮状沉淀产生;用毛细管勾出絮状沉淀，转移至装有200 μL 70%乙醇的1.5 mL离心管中进行洗涤;吸干离心管中乙醇，DNA在管中自然晾干;加入200 μL含RNA酶的1×TE缓冲液以充分溶解DNA，4 ℃或-20 ℃保存，备用。

1.3 PCR扩增与电泳检测

反应体系总体积为10 μL，分别为10×上样缓冲液（loading buffer）1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.2 μL，0.4 μmol/L引物（Primer） 0.4 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL，用双蒸水补足10 μL。扩增程序参照文献[12]，并稍作修改，95 ℃预变性4 min;95 ℃变性30 s，45～61 ℃退火 45 s（退火温度见表2），72 ℃延伸2 min，共34个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物4 ℃保存，经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳液为1×TAE缓冲液，DL 2000为DNA分子量标准，电压为135 V，电泳时间为50 min;电泳结果采用凝胶成像系统拍照记录，每个引物的扩增产物呈稳定而清晰的条带作为统计数据，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”;将数据输入计算机，对其进行统计分析。

2 结果与分析

由图1、图2、图3可见，不同的生物基因组可使用同1个引物，而对某一特定的基因组，不同引物的扩增效率是不同的，引物扩增效率的高低由其产生的多态性条带数决定。由表3可见，41个引物中可筛选出25个多态性高的引物用于扩增，这25条引物分别为UBC807、UBC810、UBC811、UBC812、UBC815、UBC818、UBC821、UBC825、UBC827、UBC834、UBC835、UBC836、UBC841、UBC842、UBC843、UBC844、UBC845、UBC846、UBC847、UBC848、UBC856、UBC857、UBC859、UBC873、UBC881;25个多态性引物对18份李种质资源进行PCR扩增，扩增出的条带数在8～23条之间，扩增出的分子量大多在150～2 400 bp之间;共扩增出条带数为385条，其中样品间相同的条带数有53条，呈多态性的条带数为332条，平均多态位点百分率为86.23%;扩增出的多态性条带占比在55.56%～100.00%之间，其中，引物UBC812、UBC815、UBC821、UBC844、UBC848、UBC881扩增出的条带多态性相对较好，多态性条带占比达到100.00%。

3 结论与讨论

目前，应用分子生物学技术对李种质资源的研究已取得较大进展。ISSR分子标记技术具有操作简单、可靠性强、重复性高等特点，但运用ISSR分子标记技术时，每个引物在不同物种上的扩增效率不同，引物的多态性水平越高，则说明物种的种质资源越丰富。因此，针对不同物种筛选出条带清晰、稳定性高的引物是必不可少的[13]。本试验筛选出的引物多态性程度相对较高，平均多态位点百分率为86.23%，说明李种质资源的遗传基础较为广泛，种质资源较为丰富，这可能与我国是李属植物的起源中心且自然分布较广有关;从41个引物中筛选出的25个引物能够很好地反映出供试李种质资源的差异性，扩增出的条带多态性占比在55.56%～100%之间，其中，引物UBC812、UBC815、UBC821、UBC844、UBC848、UBC881扩增出的条带可用于多态性标记，与刘威生等的研究结果[9，14]基本一致。