CRISPR/Cas9系统在水稻中的发展和利用

沈明晨 薛超 乔中英 龚志云

摘要：基因组学的快速发展和多种基因组编辑技术的出现，对植物科学以及农业领域中的基因功能研究和遗传改良产生了巨大影响。其中，CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术能够快速编辑各种生物体中的基因组，以其简单稳定高效等优点，成为目前最先进且被广泛运用的系统。水稻是我国最重要的粮食作物之一，其遗传资源丰富且基因组小，适合用于基因组编辑技术的研究。讨论水稻改良的基因组编辑策略，重点介绍CRISPR/Cas9系统在水稻抗病性、抗逆性、杂种优势等方面的应用和进展，强调CRISPR/Cas9在水稻改良中的主要挑战和发展意义。

关键词：水稻;CRISPR/Cas9;基因组编辑;作物改良

中图分类号： S511.01  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0005-06

水稻在不同环境条件下适应性较强，因此被世界粮食及农业组织（FAO）视为全球粮食安全的战略作物[1]。据统计到2050年，全球大米消费量将增加到6.5亿t，而要满足日益增长的人口对粮食的需求，还需要多生产40%的大米[2]。在过去的几十年里，传统的分子育种方法极大地促进了水稻产量的提高。然而，近几十年来水稻产量却逐渐下降。当前农业面临着人口快速增长、全球气候变化、病虫害以及其他环境危害等多重挑战。因此，迫切需要高产潜力、高非生物胁迫耐受性以及抗主要病虫害病原菌的水稻新品种。

近年来，基因组编辑技术的出现打破了传统育种方法的局限性，开创了作物改良的新时代。基因组编辑主要是对序列特异核酸酶（SSNs）位点进行编辑从而修饰基因组中特定位置的特定基因。目前，SSNs包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和规律间隔短回文重复序列及其相关核酸酶9（CRISPR/Cas9）[3]。其中，CRISPR/Cas9是植物生物學中最先进的基因组编辑工具[4-5]。

1 CRISPR/Cas系统

有机体通过适应性免疫保护自己免受病毒的感染，并通过DNA修复机制维护自己基因组的完整性[1，6]。例如，在细菌和古生菌中，CRISPR系统是一种针对病毒感染和质粒结合的自然适应性免疫系统，能够使特定的微生物对外来遗传物质做出反应并消除它们[1，7-10]。微生物通过转导、结合、转化接触外来遗传物质，将外来DNA的短片段整合到CRISPR区域建立防御系统，从而保护自身免受基因组入侵[10-11]。CRISPR区域包含短的重复碱基序列，被称为间隔序列，其与噬菌体或质粒等外来元素具有序列同源性[6]。

CRISPR/Cas9系统有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型这3种类型。Ⅱ型系统是目前最成功的人工核酸酶，并且被广泛应用于基因组编辑[12]。在Ⅱ型CRISPR系统中，单一的与CRISPR相关的核酸内切酶蛋白（Cas9）在crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）的引导下切割入侵的病毒基因组，从而在PAM[原型间隔序列毗邻基序，来自酿脓链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes，简称SpCas9）的NGG]上游3 bp处产生平末端DNA的双链断裂（DSB）并通过HNH（His-Asn-His）和RuvC核酸酶域分别获得互补链和非互补链[7-9，13]（图1）。另外，sgRNA（single-guide RNA）引导的R-loop（新生RNA与模板DNA通过碱基互补配对形成的杂合链和非模板DNA组成的三链结构）保证了互补链PAM上游3 bp位置的精确切割[14-15]。编码Cas蛋白的Cas基因通常位于以富集碱基AT的前导链为引导的CRISPR序列附近（图1）[6，16]。

在植物细胞中，有2种共同表达多重引导RNA的方法，用于复杂基因组的编辑。一是采用基因传递方式，将多个向导RNA表达片段构建到单独的质粒中，如基因枪法和聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转染[17]。另一种是利用农杆菌介导的基因转化方法，将多个sgRNA组装到1个载体上。这些sgRNA可以由单独的启动子驱动，或者通过植物内源性核糖核酸酶进一步加工，以单转录本的形式表达[18-20]。这2种方法都是在植物基因组中引入基因修饰的有效方法。

CRISPR/Cas9系统的开发利用，使得基因组工程得到了惊人的进展[21-22]。靶基因的敲除或者敲入在多种物种和细胞类型中被证明是可行的[9，23]。通过编辑内源性基因，开发出具有改良性状的新植物或作物，以期克服传统基因改造生物而产生的负面影响[24]。考虑到不同的应用和生物系统，仍需要不断地探索发现新的基因组编辑方法得到最合适的基因组编辑技术，从而推进各个领域的基因组发展。

2 CRISPRR/Cas系统在水稻中的应用发展

CRISPR/Cas9系统使用Cas9核糖核酸内切酶和向导RNA复合物，在许多物种中显示了非常高效的靶向基因编辑能力。自2013年以来，CRISPR/Cas9编辑系统在植物中的成功应用越来越多，包括对拟南芥、烟草、高粱、小麦中的成功应用，以及在水稻、玉米、大豆、甜橙、毛白杨和番茄中的相关研究[17-18，25-33]。在水稻中，从T0代植株获得高频率的纯合或双等位基因是可行的，且在不出现任何可检测到的新突变或回复突变的情况下，T0代植株中的基因修饰可以持续到下一代[27]。因此，CRISPR/Cas9技术让编辑特定的基因以达到预期结果的设想成为可能。目前，已有许多研究报道CRISPR/Cas9技术在水稻抗病抗逆性，杂种优势以及产量性状改良等方面的应用（表1）。

2.1 CRISPRR/Cas9系统在水稻抗病性中的应用

白叶枯病是我国水稻生产中的重要病害之一，是由白叶枯病菌引起的。该病菌在分蘖期感染植株导致叶片枯萎，严重影响水稻的产量和品质。Jiang等构建了一个由花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子驱动的编码链球菌Cas9酶和一个由水稻U6启动子驱动的sgRNA，该sgRNA的5′区域与水稻白叶枯病敏感基因OsSWEET14启动子区域中的20 bp序列互补[25]。通过聚乙二醇（PEG）转化试验，将Cas9酶和sgRNA共同转化到水稻原生质体，并培养48 h，从而使 Cas9-sgRNA 改变目标内源性基因OsSWEET14的位点。DNA测序证实了该水稻原生质体细胞中靶位点的DNA序列发生突变。为了确定Cas9基因的密码子优化是否会影响Cas9-sgRNA定向诱变效率，Jiang等还利用一种水稻中优化表达的Cas9基因，对另一个水稻白叶枯病基因OsSWEET11进行了试验，并且也获得了多个目标位点的突变[25];该研究成功证明Cas9-sgRNA系统在农业应用中是一种方便且有力的植物基因组编辑方法。

稻瘟病是水稻三大病害之一，由稻瘟病菌引起。稻瘟病几乎可以破坏水稻不同生长阶段的所有部位。考虑到稻瘟病的严重程度以及对水稻产量的影响，研究者们通过不同方面控制该病的发生，包括基因组学、感染机制研究、宿主病原体相互作用及抗性育种等。近年来，序列特异性核酸酶（SSNs）已被证明是通过基因特异性基因组编辑改进作物的有力工具，其中CRISPR/Cas9被认为是最有效的序列特异性核酸酶。Wang等设计了一个CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922）靶向水稻OsERF922基因，使水稻稻瘟病抗性提高;他们从50个T0代转基因植株中鉴定出21个C-ERF922诱导突变的植株体，所有由C-ERF922蛋白诱导的等位基因突变都会遗传给后代;进一步检测6个T2代纯合突变系的稻瘟病抗性表型和农业性状，发现在幼苗和分蘖时期，相比于野生型植株，6个突变体植株中稻瘟病病变显著减少;结果表明，通过CRISPR/Cas9基因组修饰对增强水稻稻瘟病抗性是一个有效途径[34]。Pi21是抗稻瘟病基因，因为与高垩白相关基因紧密连锁，运用传统方法难以获得抗稻瘟病且稻米品质优良的植株。王芳权等选取Pi21的2个靶位点，构建该基因的敲除载体，对其进行效率分析，发现2个靶位点突变效率分别为7857%和92.86%，靶位点同时突变的效率为 78.57%[35]。另外杨海河等利用日本晴对Pi20基因进行定点突变，也成功获得了抗稻瘟病水稻株系[36]。这些研究结果证明了CRISPR/Cas9技术推动了抗稻瘟病品种的研究进展。

2.2 CRISPRR/Cas9系统在水稻抗逆性中的利用

2.2.1 耐盐性 盐胁迫对作物不同发育阶段的生长都有影响，导致作物产量下降。随着人口的快速增长，提高作物的耐盐性是提高农业生产率的关键措施。在拟南芥中，CBL5的过表达植株增强了对高盐或干旱胁迫的耐受性，因此推测CBL5可能是植物中抗鹽抗旱性的调控因子[37]。在水稻中，陈鹏程运用CRISPR/Cas9获得OsCBL5基因敲除纯合突变体，发现其T0代的耐盐性较野生型明显提高[38]。董艳敏深入研究OsPDR1基因在水稻中的耐盐性，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑OsPDR1基因，从而得到该基因的突变株系[39]。与野生型相比，获得的突变株的耐盐性明显提高。因此，CRISPR/Cas9技术为获得更优质的抗盐性品种提供了一条高效途径。

2.2.2 抗寒性 水稻幼苗对低温特别敏感，尤其在苗期。因此，提高水稻抗寒性对改善水稻品质和产量具有重要意义。为了鉴定参与调控植物耐冷性的基因，黄小贞等利用由抑制消减杂交技术构建的耐冷基因文库进行筛选，得到一个可能与水稻耐寒性相关的转录因子TIFY 1b[40]。为了进一步研究TIFY 1b及其同源基因OsTIFY 1a，研究者利用CRISPR/Cas9技术成功构建OsTIFY 1b及其同源基因TIFY 1a的敲除载体，且突变效率高;并在T0代水稻植株中观察到位点特异性突变，且所有的突变类型都能稳定遗传到下一代[40]。该研究揭示了一种控制水稻抗寒适应性的新途径，有助于拓宽转基因抗寒水稻品种的研究范围。

2.2.3 抗除草剂性 水稻BEL（bentazon sensitive lethal）基因对苯达松和磺酰脲类除草剂具有抗性，BEL基因功能缺失突变体对除草剂敏感。在二系杂交水稻生产中，以BEL突变体为背景培育雄性不育系时，只需在苗期喷洒苯达松即可解决不育系自交杂交种子污染的问题。虽然BEL可能会提高杂交水稻的安全生产，但有限的自然遗传资源极大地限制了BEL的应用[26]。Xu等设计了3种20-nt sgRNAs与水稻抗除草剂基因BEL的PAM序列附近的不同位点配对，将sgRNA与Cas9整合到一个载体，通过农杆菌转化得到Cas9的转基因水稻植株[26]。通过对转基因植株基因组上靶位点的检测，发现其突变效率为2%～16%，双等位基因突变的株系表现为对苯达松敏感。

3-磷酸合酶（EPSPS）在所有植物和大多数细菌中都有保守的基序。这种基序对于结合磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）或其竞争性抑制剂草甘膦至关重要。在保守基序中天然的双氨基酸发生T102I+P106S的替换（双氨基酸替换类型为TIPS）会产生对草甘膦的抗性。迄今为止，还没有在栽培作物中发现自发或诱导的TIPS双重突变，其原因可能是同时发生双核苷酸替换的可能性很低。Li等用一对sgRNA靶向毗邻的内含子，获得了2%的EPSPS基因替换频率，以及2.2%的靶基因插入频率[41]。获得的水稻突变株均具有草甘膦抗性，并且特定位点的替换和插入可稳定遗传到下一代。这些新的途径可以被广泛运用到水稻或其他植物的特定基因组位点中，从而实现替换靶基因片段和插入内源DNA序列。乙酰乳酸合成酶（ALS）是氯磺隆，双草醚等除草剂中的关键酶，Sun等利用CRISPR/Cas9同源重组成功将多个离散的点突变转入到水稻ALS基因中[42]。在该研究中不仅获得了纯合的抗除草剂的水稻植株，而且验证了用该Cas9系统精确替换基因是可行且高效的。

因此，利用CRISPR/Cas9技术靶向关键功能基因有希望成为一种具有较大应用前景的促进水稻和其他主要作物育种的生物技术战略。

2.3 CRISPR/Cas9系统在水稻杂种优势中的利用

由于人口迅速增长、耕地有限和环境恶化等，人们对粮食的需求持续上升。杂交水稻已经在40多个国家得到开发利用，在全球粮食供应中发挥着关键的作用[43]。采用三系和二系杂交育种体系开发的杂交水稻在我国杂交水稻生产中占主导地位[44]。三系法采用细胞质雄性不育性（CMS），恢复系和保持系来生产杂交种子并维持不育系[45]。三系系统中恢复系和CMS的遗传多样性较低，阻碍了杂交育种的进一步发展。二系育种采用的是光敏核不育系（PGMS）或温敏核不育系（TGMS）作为特定条件下的不育系或保持系。几乎所有的水稻品种都能恢复PGMS和TGMS株系的育性，从而为更好地利用水稻杂种优势提供更广泛的遗传资源。在传统的育种系统中，开发商业化的雄性不育系通常需要几年时间，有时超过10年，而基因工程技术可以显著缩短育种时间。Zhou等利用CRISPR/Cas9系统，诱导温敏核不育（TGMS）基因的特定突变，并且发展新的纯合转基因TGMS系;他们利用CRISPR/Cas9系统在TMS5基因编码区设计了10个靶点用于靶向诱变，并评估了靶向和脱靶效应的潜在发生率;此外，还建立了最有效的结构——TMS5ab结构（靶向TMS5a基因和TMS5b基因位点的二元结构），用于培养潜在的纯合转基因TGMS系[46]。更值得关注的是，研究者利用TMS5ab结构，在仅仅1年内开发了11种新的转基因TGMS纯系，这些纯系在杂交育种上都有潜在的应用前景[46]。上述研究表明，CRISPR/Cas9系统不仅大大促进了TGMS系的育种进程，也促进杂种优势的开发利用。

一直以来，育种家们利用杂种优势生产高产优质的作物，但遗传隔离的存在常常导致有益表型在后代中丢失。无融合生殖是利用种子进行无性繁殖的一种形式。通过无融合生殖可以实现F1代杂交种的自交繁殖。Khanday（来自美国加州大学戴维斯分校Venkatesan Sundaresan教授团队）等证实了水稻杂交种无融合生殖的可行性，他们通过基因组编辑敲除BBM1、BBM2、BBM3这3个基因，结合卵细胞中BBM1基因的异位表达，获得了克隆后代并保留了全基因组亲代的杂合性，并且无融合生殖性状可以通过多代克隆遗传到下一代[47]。同一时期，我国水稻研究所王克剑团队也通过对减数分裂基因REC8、PAIR1、OSD1进行CRISPR/Cas9基因组编辑，从而固定了F1杂交稻的杂种优势，获得了无性系二倍体配子和四倍体的种子，并且证明了编辑参与受精过程的MTL（MATRILINEAL）基因可以诱导杂交水稻单倍体种子的形成;最后，同时编辑杂交水稻中REC8、PAIR1、OSD1、MTL这4个基因，将杂种优势的固定和单倍体的诱导结合起来，获得了无融合生殖植株[48]。这些研究结果表明，基因编辑技术对于水稻杂交种实现无融合生殖具有重大意义，也为将来在多种作物中实现F1杂交种的无性繁殖奠定了基础。

2.4 CRISPR/Cas9系统在改善水稻产量性状中的应用

在现代水稻种植中，高产已成为近十年来育种家和种植者的主要目标之一。水稻单株产量由3种性状决定：单株穗数、单穗粒数、粒质量[49-50]。到目前为止，一些基因已被证明会影响这些产量性状。控制水稻分蘖的有MOC1（Monoculm1O）、OsTB1（Teosinte Branched1）和IPA1（Ideal plant architecture1）[51-52];调节单穗粒数的有IPA1和Ghd7（Grains Height Date-7）、DST（drought and salt tolerance）、Gn1a（G rain number 1a）[52-54];调节籽粒大小的有GS3（Grain Size3）、GW2、GW5（Grain Weight 5）、OsSPL16（Squamosa Promoter Binding Protein-like 16）、OsPPKL1和OsglHAT1[55-61];控制穗型的有DEP1（Dense and Erect Panicle 1）[62]。Li等运用CRISPR/Cas9对水稻品种11号的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1基因进行突变，这些基因分别是用来调节水稻的单穗粒数、穗型、谷粒大小、株型[63]。分析T0代转基因植株表型和编辑基因频率的结果表明，用CRISPR/Cas9系统可实现高效基因组编辑，转基因植物效率分别为42.5%（Gnla）、67.5%（DEP1）、57.5%（GS3）、27.5%（IPA1）。Gn1a、DEP1和GS3突变体的T2代分别表现为谷粒数的增加、更紧凑直立的株型和较大的籽粒。并且在DEP1和GS3突变体中分别发现具有半矮秆和长芒谷粒表型的植株。其中IPA1突变体由于体内OsmiR156靶区域的不同，表现为2种截然不同的表型：产生较少或者较多分蘖。Li等还发现缺失突变体发生的频率高于之前的报道，且脱靶效应发生在高度相似的靶序列中[63]。这些结果表明，CRISPR/Cas9可以在1个品种中修饰多个重要性状的调控因子，从而促进对同一基因组背景下的复杂基因调控网络剖析，并且为改善目前种植品种产量性状提供了潜在的植物育种策略。

3 总结和技术展望

CRISPR/Cas9系统自2013年推出以来发展迅速，在纠正疾病突变、对抗病毒性疾病、解剖基因功能、癌症研究、细胞基因组工程、药物发现和疾病建模方面正获得越来越大的影响力。最早在基因组工程中应用的酿脓链球菌Cas9（SpCas9）蛋白，虽然存在分子量大和潜在的脱靶效应等局限性，但由于其高核酸酶活性和廣泛的靶向范围，仍被广泛地应用。不可否认的是，CRISPR/Cas9大大扩展了基因组编辑的用途，例如基因敲除的全基因组筛选、转录抑制或转录激活、利用不具有切割活性的dCas9与荧光蛋白融合进行染色体动力学分析[64-66]、利用dCas9表观遗传修饰调节因子实现表观基因组编辑和利用DNA条形码技术对细胞谱系的跟踪[67-68]。

CRISPR/Cas9系统的发现可以防止细胞病毒（噬菌体）的感染，为细菌免疫开辟了一个新途径。同时CRISPR能够以更精确、更高效、更简单的方式在基因组的靶序列上创造突变，已真正成为作物改良的最有效的工具。其主要优势在于，通过遗传隔离可以很容易地从基因组中去除那些由转基因技术引起的基因修饰，从而使经过基因编辑的植物与通过传统育种方法得到的植物之间没有差异。此外，DNA甲基化和组蛋白修饰的表观遗传调控方式可以在不改变基因组序列的情况下遗传给植物后代，因此在作物改良方面也有更大的应用前景。然而基因组编辑的应用仍存在不足，制约了其在水稻等多种作物中的进一步应用。因此，优化基因编辑技术可以进一步促进作物改良的发展。

（1）降低CRISPR基因组编辑系统对PAM序列的要求。由于对PAM的要求非常严格，大大限制了可以编辑的序列，从而影响基因组编辑的效率。目前，化脓链球菌Cas9（SpCas9）主要是识别包含NGG的PAM位点[69]。最新开发的Cas9蛋白，其“D1135”“R1335”“T1337”氨基酸分别被位点“V”“Q”“R”替换（简称VQR变体），该变体被证明可以切割含NGA的PAM位点[70]。然而，该VQR变体的编辑效率较低，限制了其在基因组编辑中的广泛应用。Hu等为了进一步扩大植物基因组编辑的范围，通过改造sgRNA结构和强内源性启动子，显著提高了VQR变体的编辑效率[71]。可替换PAM序列（3′ NAG和NGA）和Cas9变体（比如StCas9、SaCas9）拓宽了基因组编辑在植物中的应用[72]。使用几个具有不同PAM特异性的Cas9变体，将有助于扩大基因组编辑的范围。然而，并不是所有的Cas9变体在植物中都是有效的，Cas9变体仍有很大的发展空间，并且将有希望扩大谷类作物特别是水稻的基因组编辑范围。

（2）需要提高基因替換编辑的效率。因为作物育种中需要的性状是通过功能突变来实现的，通过同源重组（HR）途径进行的序列置换和片段敲入实现的基因组编辑对作物改良具有更重要的意义。但是植物中HR的效率很低，导致通过HR途径实现基因替换仍然很困难。因此需要基于HR途径更高效的基因组编辑。优化供体模板DNA的传递方式可能是获得通过HR途径实现基因替换编辑的有效途径。

（3）不能直接在早期的农地里获得经过基因组编辑的水稻和其他作物。突变植株在自然环境条件下的表现存在不确定性。解决这一问题需要对经过编辑的植株进行更多的实地观察。限制经过基因编辑过的水稻应用的另一个因素是农民田间生物安全条例。美国农业部已经免除了对许多转基因作物的严格监管[73]。欧盟法院最近裁定，使用基因组编辑技术创造的生物将作为转基因生物进行管理。这可能会对水稻种植国家对转基因水稻监管的决定。总而言之，基因组编辑技术可以在技术上创造出转基因作物，CRISPR/Cas9和相关的基因组编辑工具的确在水稻改良方面带来了革命性的变化，对于满足并保证未来人们对水稻的需求具有重大意义。

参考文献：

[1]Jasin M，Haber J E. The democratization of gene editing：insights from site-specific cleavage and double-strand break repair[J]. DNA repair，2016，44：6-16.

[2]Milovanovic V，Smutka L. Asian countries in the global rice market[J]. Acta Universitatis Agriculturae Et Silviculturae Mendelianae Brunensis，2017，65（2）：679-688.

[3]Miglani G S. Genome editing in crop improvement：present scenario and future prospects[J]. Journal of Crop Improvement，2017，31（4）：453-559.

[4]Belhaj K，Chaparrogarcia A，Kamoun S，et al. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9[J]. Current Opinion in Biotechnology，2015，32：76-84.

[5]Weeks D P，Spalding M H，Yang B. Use of designer nucleases for targeted gene and genome editing in plants[J]. Plant Biotechnology Journal，2016，14（2）：483-495.

[6]Marraffini L A，Sontheimer E J. CRISPR interference：RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea[J]. Nature Reviews Genetics，2010，11（3）：181-190.

[7]Deltcheva E，Chylinski K，Sharma C M，et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase Ⅲ[J]. Nature，2011，471（7340）：602-607.

[8]Jinek M，Chylinski K，Fonfara I，et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science，2012，337（6096）：816-821.

[9]Komor A C，Badran A H，Liu D R. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes[J]. Cell，2017，168（1/2）：20-36.

[10]Barrangou R，Fremaux C，Deveau H，et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science，2007，315（5819）：1709-1712.

[11]Marraffini L A，Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J]. Science，2008，322（5909）：1843-1845.

[12]Qi L S，Larson M H，Gilbert L A，et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression[J]. Cell，2013，152（5）：1173-1183.

[13]Gasiunas G，Barrangou R，Horvath P，et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（39）：2579-2586.

[14]Jiang F，Taylor D W，Chen J S，et al. Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage[J]. Science，2016，351（6275）：867-871.

[15]Sternberg S H，LaFrance B，Kaplan M，et al. Conformational control of DNA target cleavage by CRISPR-Cas9[J]. Nature，2015，527（7576）：110-113.

[16]Wright A V，Nunez J K，Doudna J A. Biology and applications of CRISPR systems：harnessing natures toolbox for genome engineering[J]. Cell，2016，164（1/2）：29-44.

[17]Shan Q W，Wang Y P，Li J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology，2013，31（8）：686-688.

[18]Ma X L，Zhang Q Y，Zhu Q L，et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Molecular Plant，2015，8（8）：1274-1284.

[19]Zhang Z J，Mao Y F，Ha S，et al. A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports，2016，35（7）：1519-1533.

[20]Xie K，Minkenberg B，Yang Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（11）：3570-3575.

[21]Cong L，Ran F A，Cox D，et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science，2013，339（6121）：819-823.

[22]Mali P，Yang L，Esvelt K M，et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science，2013，339（6121）：823-826.

[23]Singh V，Braddick D，Dhar P K. Exploring the potential of genome editing CRISPR-Cas9 technology[J]. Gene，2017，599：1-18.

[24]Georges F，Ray H. Genome editing of crops：a renewed opportunity for food security[J]. GM Crops & Food，2017，8（1）：1-12.

[25]Jiang W Z，Zhou H B，Bi H H，et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in arabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J]. Nucleic Acids Research，2013，41（20）：e188.

[26]Xu R F，Li H，Qin R Y，et al. Generation of inheritable and “transgene clean” targeted genome-modified rice in later generations using the CRISPR/Cas9 system[J]. Scientific Reports，2015，5：11491.

[27]Zhang H，Zhang J S，Wei P L，et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J]. Plant Biotechnology Journal，2014，12（6）：797-807.

[28]Zhou H，Liu B，Weeks D P，et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（17）：10903-10914.

[29]Jia H G，Wang N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA[J]. PLoS One，2014，9（4）：e93806.

[30]Liang Z，Zhang K，Chen K L，et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system[J]. J Genet Genomics，2013，41（2）：63-68.

[31]Fan C，Walling J G，Zhang J，et al. Conservation and purifying selection of transcribed genes located in a rice centromere[J]. The Plant Cell，2011，23（8）：2821-2830.

[32]Jacobs T B，LaFayette P R，Schmitz R J，et al. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9[J]. BMC Biotechnology，2015，15（1）：1-10.

[33]Brooks C，Nekrasov V，Lippman Z B，et al. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system[J]. Plant Physiology，2014，166（3）：1292-1297.

[34]Wang F，Wang C L，Liu P Q，et al. Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922[J]. PLoS One，2016，11（4）：e0154027.

[35]王芳權，范方军，李文奇，等. 利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21 基因的效率分析[J]. 中国水稻科学，2016，30（5）：469-478.

[36]杨海河，毕冬玲，张 玉，等. 基于CRISPR/Cas9技术的水稻Pi21 基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定[J]. 分子植物育种，2017（11）：4451-4465.

[37]Cheong Y H，Sung S J，Kim B G，et al. Constitutive overexpression of the calcium sensor CBL5 confers osmotic or drought stress tolerance in Arabidopsis[J]. Molecules and Cells，2010，29（2）：159-165.

[38]陈鹏程. 水稻OsCBL5在植物耐盐信号传导中的作用研究[D]. 金华：浙江师范大学，2015.

[39]董艳敏. 水稻OsPDR1定向突变及其在耐盐中的功能研究[D]. 南京：南京农业大学，2016.

[40]黄小贞，曾晓芳，李建容，等. 基于CRISPR/Cas9技术的水稻转录因子tify1a和tify1b突变体的创建与分析[J]. 农业生物技术学报，2017，25（6）：1003-1012.

[41]Li J，Meng X B，Zong Y，et al. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9[J]. Nature plants，2016，2：16139.

[42]Sun Y，Zhang X，Wu C Y，et al. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase[J]. Molecular Plant，2016，9（4）：628-631.

[43]Su N，Hu M L，Wu D X，et al. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production[J]. Plant Physiol，2012，159（1）：227-238.

[44]Cheng S H，Zhuang J Y，Fan Y Y，et al. Progress in research and development on hybrid rice：a super-domesticate in China[J]. Annals of Botany，2007，100（5）：959-966.

[45]Chen L，Liu Y G. Male sterility and fertility restoration in crops[J]. Annual Review of Plant Biology，2014，65（1）：579-606.

[46]Zhou H，He M，Li J，et al. Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system[J]. Scientific Reports，2016，6：37395.

[47]Khanday I，Skinner D，Yang B，et al. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds[J]. Nature，2019，565：91-95.

[48]Wang C，Liu Q，Shen Y，et al. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes[J]. Nature Biotechnology，2019，37（3）：283.

[49]Wang Y H，Li J Y. Molecular basis of plant architecture[J]. Annual Review of Plant Biology，2008，59（1）：253-279.

[50]Xing Y Z，Zhang Q E. Genetic and molecular bases of rice yield[J]. Annual Review of Plant Biology，2010，61：421-442.

[51]Minakuchi K，Kameoka H，Yasuno N，et al. FINE CULM1 （FC1） works downstream of strigolactones to inhibit the outgrowth of axillary buds in rice[J]. Plant & Cell Physiology，2010，51（7）：1127-1135.

[52]Miura K，Ikeda M，Matsubara A，et al. OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice[J]. Nature Genetics，2010，42（6）：545-549.

[53]Jiao Y Q，Wang Y H，Xue D W，et al. Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice[J]. Nature Genetics，2010，42（6）：541-U536.

[54]Li S Y，Zhao B R，Yuan D Y，et al. Rice zinc finger protein DST enhances grain production through controlling Gn1a/OsCKX2 expression[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（8）：3167-3172.

[55]Fan C C，Xing Y Z，Mao H L，et al. GS3，a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice，encodes a putative transmembrane protein[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，112（6）：1164-1171.

[56]Mao H L，Sun S Y，Yao J L，et al. Linking differential domain functions of the GS3 protein to natural variation of grain size in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（45）：19579-19584.

[57]Shomura A，Izawa T，Ebana K，et al. Deletion in a gene associated with grain size increased yields during rice domestication[J]. Nature Genetics，2008，40（8）：1023-1028.

[58]Song X J，Kuroha T，Ayano M，et al. Rare allele of a previously unidentified histone H4 acetyltransferase enhances grain weight，yield，and plant biomass in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（1）：76-81.

[59]Wang S K，Li S，Liu Q，et al. The OsSPL16-GW7 regulatory module determines grain shape and simultaneously improves rice yield and grain quality[J]. Nature Genetics，2015，47（8）：949-954.

[60]Wang S K，Wu K，Yuan Q B，et al. Control of grain size，shape and quality by OsSPL16 in rice[J]. Nature Genetics，2012，44（8）：950-954.

[61]Zhang X J，Wang J F，Huang J，et al. Rare allele of OsPPKL1 associated with grain length causes extra-large grain and a significant yield increase in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（52）：21534-21539.

[62]Huang X Z，Qian Q，Liu Z B，et al. Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in rice[J]. Nature Genetics，2009，41（4）：494-497.

[63]Li M，Li X X，Zhou Z J，et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a，DEP1，GS3，and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：377.

[64]Gilbert L A，Horlbeck M A，Adamson B，et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation[J]. Cell，2014，159（3）：647-661.

[65]Shalem O，Sanjana N E，Hartenian E，et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells[J]. Science，2014，343（6166）：84-87.

[66]Chen B，Gilbert L A，Cimini B A，et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system[J]. Cell，2013，155（7）：1479-1491.

[67]Hilton I B，DIppolito A M，Vockley C M，et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers[J]. Nature Biotechnology，2015，33（5）：510-517.

[68]McKenna A，Findlay G M，Gagnon J A，et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing[J]. Science，2016，353（6298）：aaf7907.

[69]Hsu P D，Lander E S，Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering[J]. Cell，2014，157（6）：1262-1278.

[70]Hu X X，Wang C，Fu Y P，et al. Expanding the range of CRISPR/Cas9 genome editing in rice[J]. Molecular Plant，2016，9（6）：943-945.

[71]Hu X X，Meng X B，Liu Q，et al. Increasing the efficiency of CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice[J]. Plant Biotechnology Journal，2018，16（1）：292-297.

[72]Kaya H，Mikami M，Endo A，et al. Highly specific targeted mutagenesis in plants using Staphylococcus aureus Cas9[J]. Scientific Reports，2016，6：26871.

[73]Waltz E. CRISPR-edited crops free to enter market，skip regulation[J]. Nature Biotechnology，2016，34（6）：582.