二十碳五烯酸和亚油酸对黄姑鱼肝脏细胞炎症相关基因表达的影响

吴 勋，孟祥磊，谭 朋，王立改，楼 宝

（1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021；2.嵊泗县海洋与渔业局，浙江嵊泗 202450）

鱼油是海水鱼类配合饲料的优质脂肪源，但水产养殖业的快速发展使得有限的鱼油资源不能满足水产饲料工业的需要。植物油（如豆油）因具有来源广、产量大、价格低、富含多不饱和脂肪酸等优点，是首选的鱼油替代脂肪源。然而，饲料中过高比例植物油会导致海水鱼类肝脏组织结构病变、炎症水平升高等问题[1-4]，限制了植物油在水产动物饲料中的使用。因此，有必要开展饲料中植物油替代鱼油对肝脏炎症机制的研究，为降低乃至消除饲料中植物油造成的鱼类健康问题提供理论依据，以期实现节约鱼油资源和保护鱼体健康的目的。

黄姑鱼Nibea albiflora Richardson是我国东海特有的经济鱼类，其肉质鲜美，营养丰富，在国内外市场受到广泛欢迎。随着黄姑鱼生物学特性、遗传育种、养殖技术和饲料开发等研究的深入，黄姑鱼已成为我国东海地区重要的海水养殖品种。本课题组前期研究发现黄姑鱼人工配合饲料中n-3LC-PUFA需要量约1%，豆油完全替代黄姑鱼饲料中鱼油会引起肝脏脂肪沉积和组织病变。因此，为了降低黄姑鱼配合饲料中鱼油使用量，有必要开展豆油对黄姑鱼肝脏免疫机制的研究。以往鱼类中的研究主要采用养殖实验的方式，即通过在饲料中添加不同水平（或种类）植物油，研究饲料中植物油对鱼体免疫机制的研究。然而，养殖实验普遍存在实验周期长、价格昂贵以及干扰因素多等问题，阻碍了鱼类脂肪酸免疫研究的进展。离体实验部分弥补了养殖实验的缺点，具有试验周期短和结果稳定等优点，对于研究不同脂肪酸对鱼类肝脏炎症的机制研究具有重要补充作用[5]。

饲料中植物油替代鱼油的本质是脂肪酸的替代。豆油作为海水经济鱼类饲料中最常用的植物油，其主要成分是亚油酸；鱼油中重要的抗炎脂肪酸是Omega3系列的二十碳五烯酸（EPA）。本实验拟通过LPS刺激模拟外界环境胁迫，通过比较亚油酸和二十碳五烯酸在黄姑鱼肝脏细胞炎症相关基因的表达，以期揭示豆油替代饲料中鱼油对黄姑鱼导致的炎症反应的机制，进而实现饲料中植物油“精准替代”饲料中鱼油。

1 材料方法

1.1 黄姑鱼原代肝脏组织细胞的培养

1.1.1 培养基的制备

基础培养基（100 mL）：DMEM/F12 液体培养基（Hyclone，美国）99 mL、100×青链霉素溶液（Thermo Scientific，美国）1 mL，用 NaOH 溶液（1 M，Sigma，美国）调节 pH=7.2～7.4。

完全培养基（100 mL）含有：DMEM/F12 液体培养基 83 mL、100×青链霉素溶液 1 mL、200 mmol·L-1L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Thermo Scientific，美国）1 mL 和胎牛血清（Thermo Scientific，美国）15 mL，用 NaOH 溶液（1 M，Sigma，美国）调节 pH=7.2～7.4。

1.1.2 肝脏组织原代细胞培养

选取体重约为20～30 g的健康黄姑鱼幼鱼，用含1 000 IU·mL-1青霉素和1 000 μg·mL-1链霉素的无菌海水暂养实验鱼10 h。将实验鱼用抄网捞出，用MS222（Sigma，美国）麻醉，剪断鳃放血。在灭菌培养皿中用碘伏（1%）擦拭3次，后转移至超净台中用70%酒精擦拭3次；在灭菌纱布上用解剖工具解剖试验鱼并无菌分离肝脏组织。

将分离得到的肝脏组织用镊子夹取，置于70%酒精中涮洗15 s后在装有PBS的青霉素小瓶中涮洗2次，再用基础培养基清洗2次，以清洗肝脏组织块表面的血渍和其他杂质，最后暂存于完全培养基中。

用眼科剪将肝脏组织剪成1 mm3的组织块，其间不断用基础培养基冲洗，直至澄清；清洗的目的在于去除肝脏中的血细胞和脂肪等杂质。室温下，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶（Thermo Scientific，美国）消化组织块10 min后用含有胎牛血清的培养基中和。将组织块转移到50 mL离心管中，600 r·min-1离心5 min，弃上清，重复3次，每次加入完全培养基重悬。分离得到的肝脏组织细胞使用血球计数板进行细胞计数，并用完全培养基将细胞浓度调整到1×106mL-1。在6孔板中（Corning，美国）按照每孔2×106细胞数进行接种。接种后将细胞培养板置于28℃生化培养箱中进行培养。每48 h更换培养液的50%。

1.2 脂肪酸-牛血清白蛋白溶液的配制

二十碳五烯酸和亚油酸均购自Sigma-Aldrich，美国。主要参照李庆飞[6]的方法进行配制。

1.2.1 牛血清白蛋白溶液的配制

电子天平准确称取10.0 g不含脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）粉末（Equitech-Bio，美国），加入到493 mL DMEM/F12培养基中（Thermo Scientific，美国），再加入100×青霉素链霉素溶液5 mL和10 mM VE醋酸酯1 mL。使用Nalgene 566-0020一次性无菌过滤装置（Thermo Scientific，美国）将BSA溶液过滤除菌，分装后置于4℃备用。

1.2.2 二十碳五烯酸（EPA）-牛血清白蛋白复合物（EPA-BSA）的配制

加2 mL无水乙醇（国药，中国）到100 mg EPA中，用移液器吸取其中的1/10加入至EP管中，氮气吹干，加入0.1 mL氢氧化钠溶液（1 M，Sigma，美国），轻弹混匀，使之皂化。将皂化的EPA完全转移到体积为33.1 mL的BSA（2%，含20 μM VE醋酸酯）溶液中，超声波作用5 min，0.22 μm一次性无菌过滤即配置成1 mM的EPA-BSA母液，分装后-20℃保存备用。实验开始前，将母液用2%BSA溶液稀释到需要浓度并在培养箱中预热30 min。

1.2.3 亚油酸（LNA）-牛血清白蛋白复合物（LNA-BSA）的配制

方法同DHA-牛血清白蛋白复合物（DHA-BSA）的配制，不同的是BSA溶液的体积为35.7 mL。

1.3 黄姑鱼肝脏细胞免疫刺激

LPS（lipopolysaccharide，分离自大肠杆菌，0111：B4，Sigma-Aldrich，美国）使用之前用 DMEM/F12 培养基稀释至100 mg·mL-1，用0.22 μm滤膜（Millpore，美国）过滤除菌后制成LPS母液，储存于-20℃冰箱中。使用前用完全培养基将LPS母液配成0、0.1、1.0和10.0 mg·mL-1的应用液。其中LPS浓度为0的应用液含有 1 μL·mL-1的 DMSO 溶液。

启动原代培养后7 d，将细胞培养板中黄姑鱼肝脏细胞使用胰酶消化到新的培养板中（1.0×107/孔）待细胞在培养板中贴壁后去掉原有培养基，分别加入2.5 mL浓度为0、0.1、1.0和10.0 mg·mL-1的LPS应用液孵育4 h后收集黄姑鱼肝脏细胞样本，每个处理4个重复。

1.4 黄姑鱼肝脏细胞脂肪酸孵育

启动原代培养后7 d，将细胞培养板中黄姑鱼肝脏细胞使用胰酶消化到新的培养板中（1.0×107/孔），待细胞在培养板中贴壁后去掉原有培养基，分别加入2.5 mLBSA溶液（对照）、0.1 mM二十碳五烯酸（EPA）-牛血清白蛋白复合物（EPA-BSA）、0.1 mM亚油酸-牛血清白蛋白复合物（LNA-BSA）孵育6 h；除掉培养基，加入含有1.0 mg·mL-1LPS的完全培养基。每个处理4个重复。免疫刺激4 h后收集黄姑鱼肝脏细胞样本。

1.5 细胞收集、总RNA提取、cDNA合成和荧光定量PCR

去除6孔板中培养基，用PBS清洗2～3次，将0.3 mL/孔Trizol试剂（Takara，中国）加入板中，移液器吹打消化贴壁细胞。按照说明书提供的方法提取组织总RNA。为除去基因组DNA，提取的总RNA使用RNase-Free DNase（Takara，中国）处理。RNA的完整性使用1.2%的变性琼脂糖凝胶来鉴定。总RNA采用Nano Drop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）定量。总RNA的260/280 nm吸光度满足1.8～2.0方可进行下一步反转录实验。提取的RNA按照说明书使用Primer Script TM RT reagent Kit（Takara，中国）反转录成第一链cDNA。

实时定量PCR按照之前实验方法进行[7]。PCR反应使用荧光试剂为SYBR Premix Ex TaqTM（Takara，中国），反应条件为：预变性95℃10 min，一个循环；变性95℃15 s，引物退火56～60℃15 s，引物延伸68℃30 s，40 个循环。溶解曲线：95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。检测 TLR2、TLR3、TLR22、MyD88、TNF-α、IL-1β、IL-6、SOCS3和β-actin基因的表达量，其中β-actin是内参基因。每个样本包含3个技术重复，结果取平均值作为该样本的最终数值。实验使用转录组序列进行设计（表1）。计算基因相对表达量采用2-△△CT法[8]。

表1 实验中用到的荧光定量引物序列Tab.1 Primers used in this study for qRT-PCR

1.6 数据统计

使用SPASS20.0（SPASS，Inc.，美国）进行数据分析。在处理脂肪酸对黄姑鱼肝脏组织细胞炎症基因表达的研究数据时采用单因素方差分析的方法，并进行Turkey检验。实验数据以平均值±标准误的形式呈现，P＜0.05表示存在显著差异。

2 实验结果

2.1 黄姑鱼肝脏细胞培养观察

黄姑鱼肝脏细胞原代培养启动后72 h，绝大部分细胞贴于瓶底，仅有少量漂浮在培养液中，细胞呈梭形细胞（图1a）；原代培养启动后7 d，大部分细胞呈多边形和梭形，细胞折光性良好，形状均一，生长状态良好，汇合率达到80%，台盼蓝染色法镜检其存活率≥95%（图1b）。

图1 黄姑鱼肝脏组织细胞光镜照片Fig.1 Light microphotograph for N.albiflora liver cells

2.2 LPS浓度对黄姑鱼肝脏细胞TNF-α和IL-1β基因表达的影响

实验发现：LPS 刺激黄姑鱼肝脏细胞 4 h 后相对 0 mg·mL-1（DMSO）组，0.1、1.0 和 10.0 mg·mL-1的 LPS 均可显著升高TNF-α和IL-1β基因表达量（P＜0.05），TNF-α和IL-1β基因表达量随着LPS浓度降低而降低（图2）。

2.3 EPA和LNA在黄姑鱼肝脏细胞中抑制LPS诱导的炎症效果的比较

以BSA组为对照组，分别用EPA和LNA（浓度为0.1 mM）孵育黄姑鱼肝脏组织细胞6 h，而后用1.0 mg·mL-1LPS刺激黄姑鱼肝脏组织细胞4 h，发现与LNA组相比，EPA显著降低促炎症基因TLR2、TLR22、MyD88、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表达量（P＜0.05）（图 3）。这表明，黄姑鱼原代肝脏细胞模型可用于营养免疫研究，相同浓度的EPA相对于LNA在黄姑鱼肝脏细胞中有更强的抑炎效果。

图2 LPS诱导的黄姑鱼肝脏组织细胞促炎症基因的表达Fig.2 Pro-inflammatory genes response to different dose LPS in N.albiflora liver cells

图3 EPA和LNA孵育对黄姑鱼肝脏细胞炎症相关基因表达的影响Fig.3 Response of immune-related gene to EPA and LNA in N.albiflora liver cells

3 讨论

鱼油是水产动物饲料优质的脂肪源，但有限的资源和高昂的价格已经不能满足水产饲料工业的发展，寻找合适的鱼油替代脂肪源是水产动物脂类营养的热点话题。豆油是我国产量最大的植物油，也是在水产动物饲料中应用最广泛鱼油替代脂肪源。然而，饲料中过高比例豆油替代鱼油会导致鱼体炎症反应发生，进而降低鱼体免疫力和抗病力[9]。以往的研究主要通过制备豆油不同比例替代鱼油的饲料探究豆油对鱼类免疫的影响，但是养殖温度和溶氧等物理和化学因素均会对实验结果产生影响。针对这一问题，本实验采用离体实验的方法，研究鱼油中重要脂肪酸二十碳五烯酸（EPA）和豆油中主要脂肪酸亚油酸（LNA）对黄姑鱼肝脏细胞免疫的影响，拟从离体实验角度揭示豆油引起肝脏炎症反应的机制，从而为缓解乃至解决豆油替代鱼油引起的炎症反应提供理论基础。

本研究首先探究了黄姑鱼肝脏细胞的培养方法，发现0.25%胰酶酶解的方法可以在1周左右完成黄姑鱼原代肝脏细胞培养。经过一周培养，大部分肝脏细胞呈多边形和梭形，细胞折光性良好，形状均一，生长状态良好，汇合率达到80%，台盼蓝染色法镜检其存活率≥95%（图1）。为了模拟水生环境中普遍存在的重金属、氧自由基和病原体等胁迫因素，本实验采用LPS刺激黄姑鱼肝脏细胞。LPS可直接刺激细胞的病原模式分子识别受体（如TLRs）将信号传递到细胞内，进而通过信号级联反应（如NF-kB信号通路）产生炎症因子；NF-kB作为转录因子可以结合到细胞核DNA上，启动促炎症因子诸如TNF-α和IL-1β等促炎症基因的表达[10]。实验中发现0.1、1.0和10.0 mg·mL-1的LPS均可刺激细胞中TNF-α和IL-1β基因表达（图2）。此外，在安大略鲑Salmo salar[11]、蓝鳍金枪鱼Thunnus maccoyii[12]和大西洋鳕Gadus morhua[13]等离体实验中亦发现LPS可以刺激炎症相关基因的表达。因此，本实验发现LPS可刺激黄姑鱼肝脏细胞，导致其炎症发生。

植物油替代鱼油的本质是脂肪酸的替代，豆油替代鱼油导致饲料中LNA含量的升高以及Omega3脂肪酸（如EPA）含量的降低。本实验中发现，EPA较LNA和BSA显著降低了促炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因表达量，这可能与EPA抑制TLRs有关。在哺乳动物中发现Omega3 LC-PUFA可以通过抑制TLR4-MyD88介导NF-kB信号通路的激活进而抑制促炎症因子的产生[14-15]。此外，Omega3 LC-PUFA还可以直接影响NF-kB通路配体IκB的磷酸化，直接抑制促炎症基因的转录[16]。本实验结果发现，EPA显著降低了TLR2和TLR22（鱼类特有）以及接头分子MyD88基因的表达，这与花鲈中的结果类似[17]。

本实验通建立黄姑鱼肝脏离体细胞模型，发现其对LPS存在免疫响应，有效模拟了自然条件下金属、氧自由基和病原体等胁迫因素；分别将鱼油代表性脂肪酸EPA和豆油代表性脂肪酸与BSA形成复合物，孵育肝脏细胞，模拟在体条件下鱼油和豆油饲料，研究豆油导致肝脏炎症的原因，发现其可能是通过影响TLRs-NF-kB信号通路实现的。本实验的开展为研究黄姑鱼人工配合饲料植物油替代鱼油引起的炎症反应提供了新思路，这将为降低乃至消除饲料中植物油造成的鱼类健康问题提供理论依据，进而实现节约鱼油资源和保护鱼体健康的目的。

4 结论

（1）本研究建立的黄姑鱼原代肝脏细胞模型可用于营养免疫研究；

（2）1.0 mg·mL-1的LPS刺激下，黄姑鱼肝脏细胞中0.1 mM的EPA相比LNA有更强的抑炎效果。