丁酸钠通过激活cAMP通路在脂肪肝细胞模型中增加线粒体生成及脂肪氧化

柯比伦?谭嗣伟?易家志?刘慧玲?江洁?吴斌

【摘要】目的 探討丁酸钠对肝脏细胞代谢保护作用机制以及其与线粒体功能的关系。方法 采用1c1c7肝细胞进行实验，检测线粒体及脂肪氧化相关转录基因、蛋白表达以及三磷酸腺苷（ATP）生成。首先使用棕榈酸对细胞进行培养检测线粒体相关基因;其后使用棕榈酸+丁酸钠共培养细胞并将其对线粒体和氧化相关基因的效应与棕榈酸单独培养相对照;接着单独以丁酸钠处理细胞后观察其对线粒体功能和线粒体相关复合体蛋白的变化趋势;最后检测丁酸钠处理细胞后线粒体功能相关的环磷酸腺苷（cAMP）通路变化趋势。结果 棕榈酸可导致线粒体功能相关PGC-1α转录受抑;相反，加入丁酸钠与其共培养处理后细胞线粒体及氧化相关功能基因转录增强;使用丁酸钠培养细胞后线粒体蛋白复合体2转录增加，线粒体ATP生成明显增加;1c1c7细胞使用丁酸钠培养后，线粒体功能相关的cAMP通路有相应变化，我们发现p-CREB表达增加同时PDE3B受抑制，表明cAMP通路的激活。结论 丁酸钠可能通过cAMP通路介导其对肝脏脂肪变性中线粒体功能的保护作用。

【关键词】丁酸钠;脂肪肝;线粒体功能;环磷酸腺苷

Sodium butyrate promotes mitochondria biogenesis and lipid oxidation through activating cAMP pathway in fatty liver cell model Ke Bilun， Tan Siwei， Yi Jiazhi， Liu Huiling， Jiang Jie， Wu Bin. Depart-ment of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wu Bin， E-mail： wubin6@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the mechanism underlying the effect of sodium butyrate on protecting liver metabolism and its relationship with mitochondrial function.  Methods The 1c1c7 cells were chosen for subsequent experiment. The expression levels of mitochondria and lipid oxidation-related genes and proteins and the production of adenosine triphosphate （ATP） were quantitatively detected. The 1c1c7 cells were cultured by palmitic acid to detect mitochondria-related genes. Subsequently， the cells were co-cultured with palmitic acid combined with sodium butyrate. The effect of palmitic acid combined with sodium butyrate and palmitic acid alone upon the mitochondria and lipid oxidation-related genes was statistically compared. The variation trend of mitochondrial function and mitochondria-related complex protein was observed after the cells were treated with sodium butyrate alone. The changes of the mitochondrial function-related cyclic adenosine monophosphate （cAMP） signaling pathway were detected following sodium butyrate treatment. Results Palmitic acid suppressed the translation of mitochondrial function-related PGC-1α. Conversely， palmitic acid combined with sodium butyrate treatment enhanced the translation of mitochondria and lipid oxidation-related genes. The translation of mitochondrial protein complex 2 and the production of mitochondrial ATP were strengthened after sodium butyrate treatment. The changes of mitochondrial function-related cAMP signaling pathway were observed after the 1c1c7 cells were cultured with sodium butyrate. The expression of p-CREB was up-regulated， whereas that of PDE3B was down-regulated， suggesting that the cAMP signaling pathway was activated.  Conclusion Sodium butyrate probably mediates the protective effect upon the mitochondrial function via the cAMP signaling pathway in the in fatty liver cell model.

【Key words】Sodium butyrate;Fatty liver;Mitochondrial function;cAMP

近期有研究表明，丁酸钠对动物模型肥胖具有保护作用，并且其重要作用靶点是线粒体，相关研究表明其在动物实验中可通过增加脂肪氧化、线粒体呼吸等对线粒体功能起到促进作用。其作用的器官主要为肝脏，能改善高脂饮食模型下的脂肪肝状态，在骨骼肌及棕色脂肪中也有类似效应[1]。由于长链脂肪酸对线粒体功能主要表现为抑制及促凋亡，我们拟比较短链脂肪酸与其对线粒体功能的差异，并且用长链、短链脂肪酸共同培养细胞，以模拟使用短链脂肪酸治疗食源性脂肪肝的模型。我们的研究表明，丁酸钠可以减轻由棕榈酸造成的细胞线粒体相关蛋白和功能的损害，增加能量消耗，并且该作用可能通过环磷酸腺苷（cAMP）通路介导。这为我们日后进一步研究其对脂肪肝的保护机制、保护并促进线粒体功能，并将丁酸钠使用于临床对脂肪肝的防治提供了初步依据。

材料与方法

一、材 料

DMEM高糖培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum， FBS）、PBS和0.05% EDTA胰酶均购自GiBCO公司。无脂肪酸的胎牛血清（BSA，03117405001）购自罗氏公司，棕榈酸 （P5585）购自Sigma公司，丁酸钠（B5887）购自Sigma公司。细胞蛋白提取液CytoBusterTM Protein Extraction Reagent购自美国Novagen公司。溴酚蓝、SDS、丽春红S、吐温-20℃、1.5 mol/L Tris-cl pH 8.8 和1 mol/L Tris-cl pH 6.8、丙烯酰胺均购自Sigma-Aldrich公司。预染蛋白质分子量Marker购自Fermentas公司。脱脂牛奶购自Cell signaling公司。PVDF膜和化学发光液Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate购自美国Millipore公司。Restore Western BlotStripping Buffer购自Thermo Scientific公司。DTT、 Apotinin、 NP40、PMSF购自德国Boehringer公司。BCA Protein Assay Kit 购自PierceTM。PCR： 定量PCR反应试剂盒SuperScriptTMⅢ Platinum? SYBR? Green One-Step qRT-PCR Kit等购自Invitrogen公司。Tris饱和酚、甘氨酸、氯仿、异丙醇、异戊醇、无水乙醇及NaCl、EDTA、NaOH、NaAc、K2HPO4、KH2PO4和甲醛、甲酰胺、蔗糖、甘油等均购自Sigma公司。

二、方 法

1. 细胞培养

1c1c7细胞（上海中科院ATCC细胞库）用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，置于37℃，饱和湿度和5%CO2培养箱中培养，每2 ～ 3 d传代一次。接种密度约8×105/孔至6孔板中。分别将不同处理加入细胞培养液中按时间点培养及收取。首先使用0.3 mmol/L

胎牛血清作为对照，以及BSA 0.3 mmol/L棕榈酸作为处理组培养细胞8 h，收取细胞提取RNA并检测线粒体相关基因PGC-1α。随后在6孔板培养的1c1c7细胞中加入0.3 mmol/L棕榈酸作为对照组，以及0.3 mmol/L棕榈酸+10 mmol/L丁酸钠作为实验组，设置1、4、8 h作为培养时间，培养后进行RNA提取，检测线粒体相关PGC-1α，脂肪氧化相关的CPT1α以及脂肪生成相关基因SREBP。接下来，按不同时间点（0、1、4、8、16 h）使用10 mmol/L丁酸钠培养细胞及收取细胞提取蛋白进行蛋白免疫印迹试验，并按不同时间点（0、1、2、4、8、16、24 h）收取细胞使用ATP试剂盒进行检测。最后，检测cAMP通路表达情况，设置空白对照、10 mmol/L丁酸钠组以及10 μmol/L forskolin处理细胞，8 h后收取细胞提取RNA检测PDE3B转录情况;在1c1c7细胞中加入0.3 mmol/L棕榈酸作为对照，以及0.3 mmol/L棕榈酸+10 mmol/L丁酸钠作为实验组，培养8 h后进行RNA提取并检测;设置不同时间点（0、1、4、8、16 h）收取细胞提取蛋白检测p-CREB及PDE3B以及内参蛋白水平。

2. 细胞蛋白的收取及蛋白免疫印迹法试验

细胞培养过程完毕后，将培养皿放置于冰上，冰PBS液漂洗后用300 ml的裂解液，超声裂解细胞6下3次。以12 000转/分的速度，4℃离心15 min，吸取上清即为细胞裂解液，用BCA法进行蛋白定量并平衡浓度。加适量的4×loading buffer，混匀后，用水浴100℃煮沸5 min，以800转/分的速度离心后，收集上清，于-70℃保存，蛋白待测分析。将样品上样至不同浓度的 SDS-PAGE分离胶，用适当的电压电泳、转PVDF膜，封闭后用相应一抗溶液在4℃下摇动孵育过夜。次日洗膜后用HRP标记的二抗孵育2 h，洗膜后暗房曝光。

3. RNA提取及PCR

培养细胞及收取细胞后，按RNA提取试剂盒说明提取RNA，测定浓度及纯度，根据qPCR逆转录试剂盒合成cDNA。应用SYBR Green法对目的基因及内参基因进行Real-time PCR扩增。

4. ATP活性检测

收取细胞，配制ATP检测试剂体系：D-Luciferin 10 mmol/L 0.2 ml， Luciferase， firefly recombinant 1 ml， Dithiothreitol （DTT）1 mmol/L 40 ml， 20× Reaction Buffer 0.2 ml， ddH2O 3.56 ml。總体积4 ml。配好后避光保存并于数小时内使用。按浓度梯度配好ATP标准品作为参照。将样品加入96孔板中，10 ml/孔，加入5个浓度梯度对照的ATP标准品。加入100 ml/孔的检测液，立即于荧光下读取数值。

三、统计学处理

应用SPSS 21.0进行统计学分析。正态分布定量资料用表示，2组间比较使用独立样本 t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、棕榈酸培养导致1c1c7细胞线粒体相关基因转录的变化

使用0.3 mmol/L棕榈酸造模8 h后收取细胞提取RNA并检测线粒体相关基因PGC-1α，比较8 h后对照组及实验组区别。结果显示1c1c7细胞PGC-1α在棕榈酸培养后显著降低（t =3.84，P=0.031），见图1。

二、棕榈酸对比棕榈酸+丁酸钠共培养对1c1c7细胞线粒体功能的变化

使用1c1c7细胞，加入0.3 mmol/L棕榈酸作为对照组，以及0.3 mmol/L棕榈酸+10 mmol/L丁酸钠作为实验组，培养后进行蛋白质及RNA提取，检测线粒体相关PGC-1α，脂肪氧化相关的CPT1α以及脂肪生成相关基因SREBP。结果显示经丁酸钠共培养后，细胞线粒体相关PGC-1α（与1 h 棕榈酸组进行比较，4 h 棕榈酸组 = 0.97±0.03，LSD-t = 0.18， P = 0.86; 8 h 棕榈酸组 = 0.49±0.02，LSD-t = 4.03，P = 0.03; 1 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 2.36±0.12，LSD-t = 15.08，P < 0.01; 4 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 4.77±0.24， LSD-t = 53.14， P < 0.01; 8 h 棕榈酸+丁酸钠组=3.66±0.33，LSD-t = 188.05， P < 0.01; 4 h 棕榈酸组与4 h 棕榈酸+丁酸钠组比较，LSD-t = 79.55，P < 0.01; 8 h 棕榈酸组与8 h 棕榈酸+丁酸钠组比较，LSD-t = 274.21，P < 0.01）及脂肪氧化相关的CPT1α（与1 h 棕榈酸组进行比较，4 h 棕榈酸组 = 1.80±0.13，LSD-t = 6.30， P < 0.01; 8 h 棕榈酸组 = 1.19±0.03， LSD-t = 1.21， P=0.31; 1 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 1.50±0.09，LSD-t = 3.44， P =0.04; 4 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 2.23±0.12， LSD-t = 3.38， P= 0.04; 8 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 1.37±0.02， LSD-t = 2.65， P = 0.07; 4 h 棕榈酸组与4 h 棕榈酸+丁酸钠组比较，LSD-t = 3.39， P = 0.04; 8 h 棕榈酸组与8 h 棕榈酸+丁酸钠组比较，LSD-t = 6.88， P < 0.01）均比单纯棕榈酸培养升高，同时脂肪生成的SREBP（与1 h 棕榈酸组进行比较，4 h 棕榈酸组 = 1.21±0.06，LSD-t = 1.65，P = 0.20;8 h 棕榈酸组 = 1.13±0.02，LSD-t = 1.05，P = 0.37;1 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 0.98±0.05，LSD-t = 0.13， P = 0.90; 4 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 0.54±0.03，LSD-t = 5.14， P = 0.01; 8 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 0.27±0.03，LSD-t = 91.12， P < 0.01; 4 h 棕榈酸组与4 h 棕榈酸+丁酸钠组比较，LSD-t = 47.69，P < 0.01; 8 h 棕榈酸组与8 h 棕榈酸+丁酸钠组比较，LSD-t = 689.60，P < 0.01）均较单独棕榈酸培养组下降，见图2。

三、丁酸钠对细胞线粒体复合体及ATP生成的影响

按不同时间点使用10 mmol/L丁酸钠培养细胞及收取细胞，提取线粒体蛋白用于检测各个复合体相关蛋白，并收取细胞使用ATP试剂盒进行检测。结果表明，线粒体复合体蛋白complex 2 SDHA及complex 3随时间推移呈现明显升高的趋势，见图3A。相应的，随着使用丁酸钠培养时间的推移，细胞ATP产生随时间增加而增加，其峰值约为8 ～ 16 h，提示其线粒体活性增加。不同时间点的样本与初始对照组样本的差异均有

统计学意义（1 h = 1.16±0.01，LSD-t = 41.45; 2 h

= 1.36±0.03，LSD-t = 106.54; 4 h = 1.67±0.03，LSD-t = 314.24; 8 h = 1.90±0.04， LSD-t = 441.66; 16 h = 1.69±0.09， LSD-t = 70.48; 24 h = 1.47±0.04， LSD-t = 110.04，P均< 0.01），见图3B。此部分结果提示丁酸钠处理可通过对线粒体复合体的作用，进而刺激细胞线粒体相关功能。

四、丁酸钠通过抑制PDE3B导致p-CREB表达，激活cAMP通路

cAMP通路在线粒体发挥各项生理功能时具有重要影响。由于丁酸钠已被证实可促进线粒体生成及功能，我们选取控制线粒体生成和调控的相关通路cAMP通路进行研究。使用丁酸钠及对cAMP通路抑制的forskolin处理细胞，8 h后收取细胞提取RNA检测PDE3B转录情况，发现丁酸钠可显著降低PDE3B转录，而forskolin对PDE3B转录具促进作用（与对照组比较，丁酸钠组 = 0.50±0.06，LSD-t = 8.99， P < 0.01;forskolin = 2.35，LSD-t = 3.49，P = 0.04），见图4A。使用1c1c7细胞，加入0.3 mmol/L棕榈酸作为对照，以及0.3 mmol/L棕榈酸+10 mmol/L丁酸钠作为实验组，培养8 h后进行RNA提取，发现棕榈酸导致PDE3B表达升高，而使用丁酸钠共培养后，PDE3B水平较单独棕榈酸组下降（与1 h 棕榈酸组比较，1 h 棕榈酸+丁酸钠组 = 1.15±0.24，LSD-t = 0.54，P = 0.62; 8 h 棕榈酸组 = 2.86±0.27，LSD-t = 12.59，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸+丁酸钠组 = 1.89±0.08，LSD-t = 8.82，P < 0.01; 8 h 棕榈酸组与8 h 棕榈酸+丁酸钠组比较，LSD-t = 5.19， P = 0.01），见图4B。进一步提取蛋白检测通路相关的p-CREB及PDE3B，发现丁酸钠可于蛋白水平上抑制PDE3B并促进p-CREB表达，见图4C。实验结果初步表明丁酸钠可激活线粒体功能，并且可能是通过抑制PDE3B从而激活cAMP通路介导的，使用丁酸钠处理细胞可减轻由棕榈酸导致的线粒体功能下降。

讨论

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指除外酒精和其他明确的肝损害因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征[2]。NAFLD在我国成人的患病率为10% ～ 30%，近年发病率呈持续上升趋势，现已成为我国最常见的慢性肝病之一[3]。

肝脏在能量代谢中有举足轻重的作用，主导糖类、蛋白和脂肪的代谢，而线粒体是代谢中主要起作用的细胞器，因此有一部分理论认为，脂肪肝实质上可被归为线粒体病[4-5]。线粒体主导细胞脂质的β-氧化、细胞的氧化磷酸化以及介导凋亡等[6]。NAFLD的发病中，肝脏经高脂处理后线粒体功能受损，并导致脂肪氧化、活性氧簇以及氧化压力的变化，进一步表现为线粒体相关基因转录减少、线粒体呼吸链受损等，相关反应促进凋亡，导致脂肪氧化及能量产生减少[7]。cAMP是主导代谢及线粒体功能的主要通路之一，众所周知，其可主导线粒体对脂肪的氧化，以及在代谢中的其他重要作用，如脂肪分解、糖异生等，且通过PGC-1α控制线粒体生成[8-9]。

近年来，肝-肠轴在内毒素对炎症和代谢中的重要性越来越被重视。作为在肠道中占主要作用的短链脂肪酸，丁酸是研究相对充分的短链脂肪酸。初步研究表明其与改善肠道菌群及肥胖、胰岛素抵抗状态相关。我们的研究已经证实了在小鼠模型上使用丁酸钠腹腔注射能减轻内毒素引起的肝脏损伤[10]。我们进一步研究发现，丁酸钠能促进线粒体功能激活，主要表现为使ATP生成增加，并促进部分线粒体复合体蛋白表达。我们使用棕榈酸+丁酸钠共培养以模拟高脂所致非酒精性脂肪肝状态下，使用丁酸钠治疗的效果。区别于棕榈酸导致线粒體损伤以及线粒体相关PGC-1α的表达减低，使用丁酸钠共培养能明显促进PGC-1α较对照组的表达，并且激活脂肪氧化相关基因CPT1α。进一步我们通过检测线粒体相关cAMP通路，发现使用丁酸钠培养细胞后PDE3B抑制的同时p-CREB激活，这可能是丁酸钠介导线粒体功能相关的分子机制。

丁酸钠对细胞的作用是多方面的，我们的研究初步表明，在其作用下脂肪生成相关基因SREBP转录有明显下降，这说明丁酸钠可能通过不止一种机制改善细胞的脂肪代谢状态。目前为止，丁酸钠对代谢的研究多在动物实验中进行，由于作为短链脂肪酸，丁酸钠也具有脂肪酸的特性，培养细胞时可能导致细胞单纯脂肪积累的增加，这点在以丁酸钠诱导3T3-L1细胞成脂时已经有体现，然而脂肪肝的形成不仅是脂肪积累的变化，依据二次打击学说甚至多次打击学说，细胞脂肪积累后导致的炎症状态、线粒体损伤等是进一步导致脂肪肝进展的关键因素。我们采用细胞模型，意图减少在动物模型上各器官和体内激素水平等反馈造成的整体效应。我们的研究结果表明丁酸钠在肝细胞上可以增加ATP生成，促进线粒体生成相关基因PGC-1α的表达;使用棕榈酸培养模拟高脂相关的脂肪肝模型，并加入丁酸钠处理作为对照组，发现使用丁酸钠后，线粒体和脂肪氧化相关的PGC-1α、CPT1α以至于脂肪生成的SREBP都较棕榈酸组明显变化，提示了丁酸钠处理的细胞相对有更高的线粒体活性、脂肪氧化，以及更低的脂质生成。

本研究仍有待改进之处，我们的研究主要在细胞模型上进行，这可以更好地对细胞内的反应、通路进行控制，然而它在机体整体水平内丁酸钠对代谢产生的效应仍需探究。另外，有其他研究表明丁酸钠可能通过不止一方面的机制对代谢产生影响，有报道表明其通过抑制组蛋白乙酰化从而调控肿瘤生成相关基因[11]。有研究发现向怀孕及哺乳期母鼠食物添加丁酸钠，其子代骨骼肌线粒体表达PGC-1α、GPR43和GPR41都明显上升[12]。另有研究证实短链及中链脂肪酸在内皮及单核细胞内可增强线粒体功能以及线粒体呼吸能力，并可一定程度上抵抗炎症反应带来的线粒体损伤，具体通路未明，在肝脏中是否存在类似反应尚不明确，值得进一步研究[13]。同时我们也未能对线粒体各复合体以及氧化磷酸化进行系统的检测，以确定丁酸钠作用的具体靶复合体以及作用过程，这些都仍需深入研究。

综上所述，本研究通过使用丁酸钠培养肝细胞株1c1c7后检测线粒体功能，以及对照丁酸钠与棕榈酸对1c1c7线粒体的作用，发现丁酸钠可减轻棕榈酸导致的线粒体功能下降，进一步发现丁酸钠可通过抑制PDE3B激活cAMP通路，这可能是丁酸钠介导线粒体功能变化的机制。这对脂肪肝治疗的临床应用可能起到一定的提示意义。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-06-28）

（本文编辑：杨江瑜）