外周感觉神经通过Wnt5a调控正畸牙移动的骨改建过程

卢业明?麦志辉?陈正?陈琳?邝志立?彭云?艾虹

【摘要】目的 研究正畸牙移動（OTM）过程中外周神经对Wnt信号通路的调控以及它们在正畸成骨过程中的作用。方法 分别建立OTM模型和辣椒素去感觉神经模型：将36只SD大鼠随机分为不注射辣椒素+不进行牙移动组（对照组）、不注射辣椒素+牙移动组（牙移动组）、注射辣椒素+不进行牙移动（去神经组）、注射辣椒素+牙移动（去神经+牙移动组），每组各9只大鼠。使用逆转录定量 PCR（qRT-PCR）检测移动牙周围牙槽骨Wnt5a和Wnt10b的mRNA表达水平，通过免疫组织化学染色（免疫组化）检测各组右侧上颌第一磨牙牙根张力侧Wnt5a和骨钙素的表达变化。结果 在SD大鼠上进行OTM后，牙槽骨中Wnt5a和Wnt10b mRNA水平上调（P均< 0.05）。使用辣椒素去感觉神经后，有OTM大鼠Wnt5a mRNA与无OTM大鼠相近（P > 0.05），而Wnt10b mRNA水平仍升高（P < 0.05）。免疫组化示，正常SD大鼠OTM 9 d后，张力侧牙周膜内Wnt5a蛋白和成骨标志物骨钙素蛋白表达水平上调（P均< 0.05），但辣椒素去感觉神经后Wnt5a和骨钙素蛋白表达水平被显著抑制，与无OTM大鼠相近（P均> 0.05）。结论 感觉神经在OTM诱导的骨改建过程中起着重要的作用。感觉神经可能通过调控Wnt5a的表达而调控OTM中的骨改建过程。

【关键词】感觉神经;正畸牙移动;Wnt通路

Peripheral sensory nerves regulate orthodontic tooth movement-induced bone formation via Wnt5a signaling pathway Lu Yeming， Mai Zhihui， Chen Zheng， Chen Lin， Kuang Zhili， Peng Yun， Ai Hong. Department of Stomatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Peng Yun， E-mail： pengyun9@ mail. sysu. edu. cn; Ai Hong， E-mail： aih_zssy09@ 126. com

【Abstract】Objective To investigate whether peripheral sensory nerves regulate the Wnt signaling pathway and their potential roles in the bone formation during the process of orthodontic tooth movement （OTM）.  Methods SD rat models with OTM and sensory denervation with capsicin were established. Thirty-six SD rats were randomly and evenly divided into four groups： no capsaicin injection + no OTM group （control group）， no capsaicin injection + OTM group （OTM group）， capsaicin injection + no OTM group （denervation group） and capsaicin injection + OTM group （denervation + OTM group）. The expression levels of Wnt5a and Wnt10b mRNA in the alveolar bone were measured by qRT-PCR. The changes in the expression of Wnt5a and osteocalcin on the root tension side of the right maxillary first molar were measured by immunohistochemistry. Results The expression levels of Wnt5a and Wnt10b mRNA were significantly up-regulated after OTM in SD rats （both P < 0.05）. After sensory denervation with capsaicin， the expression of Wnt5a mRNA in SD rats with OTM was similar to that in SD rats without OTM （P > 0.05）， whereas the expression level of Wnt10b mRNA was significantly up-regulated （P < 0.05）. Immunohistochemistry revealed that the expression levels of Wnt5a and osteocalcin （osteogenic marker） proteins on the tension side were significantly up-regulated in normal SD rats at 9 d after OTM （both P < 0.05）， whereas remarkably down-regulated after sensory denervation with capsicin， which were similar to that in SD rats without OTM （both P > 0.05）. Conclusion Sensory nerves play a pivotal role in the OTM-induced bone formation， which probably modulate the bone formation during OTM by regulating the expression level of Wnt5a.

【Key words】Sensory nerve;Orthodontic tooth movement;Wnt signaling pathway

正畸牙移动（OTM）的基础是牙槽骨的适应性改建，即压力侧主要发生骨吸收，张力侧主要发生骨形成[1]。OTM具体的调控机制一直是正畸研究的热门方向。近年来，不少文献报道周围神经系统与骨改建密切相关[2]。通常交感神经更多地参与破骨过程，而感觉神经则与骨形成关系更密切。有学者使用高剂量辣椒素（150 mg/kg）去除感觉神经后，大鼠肱骨近端的骨小梁体积和力学性能（强度、硬度等）下降[3]。另有学者观察到注射辣椒素8周后，大鼠胫骨的骨小梁体积减少[4]。机械刺激能够上调神经生长因子（NGF）和感觉神经中的NGF-TrkA信号，促进骨形成[5]。在OTM期间，牙周膜中降钙素基因相关肽（CGRP）的表达增加[6]。骨髓间充质干细胞和成骨细胞也表达CGRP和P物质的受体[2， 7]。然而，感觉神经调节骨改建的具体机制仍未被阐明。Wnt信号通路在成骨分化和骨形成中均起重要作用[8]。骨髓间充质干细胞转染脂联素后，β-连环蛋白（β-catenin）和细胞周期蛋白（cyclinD1）等Wnt/β-catenin信号通路相关的分子表达明显上调，成骨分化和骨形成能力增强[9]。Wnt-16缺陷的小鼠则表现出低皮质骨厚度，高皮质孔隙率和自发性骨折[10]。机械力刺激能激活干细胞中的Wnt信号通路并促进成骨分化。给予牙周膜干细胞静压力刺激1 h后，Wnt/β-catenin信号通路激活，成骨分化能力增加[11]。在OTM期间，外周感觉神经标志物CGRP在牙周膜中高度表达[6]。外周感觉神经可能通过Wnt信号通路调控OTM骨形成，但其中具体机制仍有待阐明。本研究初步探讨了外周感觉和Wnt信号通路在OTM骨形成过程中的作用，为OTM的具体机制提供一定的理论基础。

材料与方法

一、OTM模型和去感觉神经模型的建立

本实验动物购于中山大学东校区实验动物生产中心。将36只8周龄的雄性无特定病原体（SPF）级SD大鼠（200 ～ 220 g） 按随机数字表法分成4组：不注射辣椒素+不进行牙移动组（对照组）、不注射辣椒素+牙移动组（牙移动组）、注射辣椒素+不进行牙移动组（去神经组）、注射辣椒素+牙移动组（去神经+牙移动组），每组各9只大鼠。每组其中3只大鼠用于实时荧光定量PCR检测，其余用于免疫组织化学染色（免疫组化）检测。根据Ding等[3]的方法建立去感觉神经模型。辣椒素（Sigma，美国）溶于10%吐温80+10%无水乙醇+80%生理盐水中。对照组及牙移动组大鼠注射10%吐温80+10%无水乙醇+80%生理盐水。其他2组大鼠建立去神经模型：每日注射辣椒素前，从上午10时至下午4时予禁水（防止辣椒素注射的并发症），将辣椒素溶液注射到大鼠后颈部皮下，并将针头留在皮下60 s以防止渗漏。连续注射3 d，每日剂量分别为30、50、70 mg/kg。最后一次注射的7 d后，参照An等[12]的方法，在牙移动组、去神经+牙移动组大鼠建立OTM模型：用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉大鼠。将镍钛弹簧安置于右上颌第一磨牙和上颌中切牙之间，并用不锈钢结扎线固定，施加50 g正畸力。9 d后处死所有大鼠，取材用于逆转录定量 PCR（qRT-PCR）和免疫组化检测。

二、qRT-PCR检测

在OTM 9 d后取大鼠右上颌第一磨牙及其周围牙槽骨，在液氮中研磨成粉末。使用Eastep? Super Total RNA Extraction试剂盒（Promega， 中国）提取总RNA，使用PrimeScriptTM RT Master Mix （Takara， 日本） 和SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ （Takara， 日本）进行逆转录和荧光定量，引物设计如表1所示。

表 1                 qRT-PCR 引物序列

基 因 引 物 产物

长度

Wnt5a 正向5-CCACAAGAGACAGCTAGGGC-3 305 bp

反向5-AGAGCATGAGCCTTTTCGGT-3

Wnt10b 正向5-CCGTGAGTTAGGTCGAGCAG-3 202 bp

反向5-GTGGGGAAACTGTGTGGAGT-3

三、免疫组化

将扫描完的样品用10%乙二胺四乙酸（EDTA，賽维尔，中国）脱钙2个月，每3 d更换一次脱钙液。脱钙完成后，沿着矢状面进行石蜡切片，以获得完整的牙根和周围的牙周组织，切片厚度为4 μm。用EDTA（百奥斯生物，中国）进行抗原修复，3%H2O2孵育20 min，10%山羊血清封闭20 min，一抗4℃孵育过夜。一抗如下：Wnt5a（Affinity，美国;1∶300）、骨钙素（OCN，Arigo，中国;1∶1000）。使用HRP-山羊抗大鼠IgG二抗（antGene，中国）和Dako REALTM EnVisionTM Detection System试剂盒（DAKO，丹麦）进行二氨联苯胺（DAB）染色。使用NanoZoomer S360（Hamamatsu，日本）扫描切片。使用Image Pro Plus 6.0测量右上颌第一磨牙根远中牙周膜的平均光密度。

四、统计学处理

实验重复3次，实验数据以表示。使用SPSS 23.0进行统计分析。组间比较使用析因设计资料的方差分析，交互效应有统计学意义时，行单独效应分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、去感觉神经抑制OTM诱导的Wnt5a的表达

1. qRT-PCR结果

牙移动组大鼠进行了9 d的OTM后，其牙槽骨中Wnt5a mRNA表达上调（图1A）。但去神经+牙移动组大鼠处理9 d后Wnt5a表达无明显变化，表明Wnt5a mRNA的表达受到感觉神经的影响。析因设计资料方差分析显示，两因素间的交互效应有统计学意义（F = 17.197，P = 0.002），因此分析单独效应，结果显示牙移动组大鼠牙槽骨中Wnt5a mRNA表达高于去神经+牙移动组（t = 6.835，P < 0.001）;去神经组大鼠Wnt5a mRNA表达与去神经+牙移动组大鼠比较差异无统计学意义（t = 1.237，P = 0.247）。无论是否去神经，OTM后Wnt10b mRNA的表达均上调（图1B），表明Wnt10b的表达不受感觉神经的影响，析因设计资料方差分析结果表明，OTM的主效应有统计学意义，OTM大鼠Wnt10b mRNA表达高于无OTM大鼠（F = 22.471，P < 0.001）;去神经的主效应无统计学意义（F = 1.317，P = 0.272）;两因素间的交互效应无统计学意义（F = 0.001，P = 0.975）。

2. 免疫组化检测结果

牙移动组大鼠的张力侧牙周膜中Wnt5a 蛋白表达高于对照组;但去神经+牙移动组大鼠的Wnt5a蛋白表达无上调。两因素间的交互效应有统计学意义（F = 6.549，P = 0.018），因此分析单独效应，结果显示牙移动组大鼠张力侧牙周膜中Wnt5a蛋白表达高于去神经+牙移动组大鼠（t = 4.548，P < 0.001）;去神经组大鼠Wnt5a蛋白表达与去神经+牙移动组大鼠比较差异无统计学意义（t = 0.123，P = 0.903），见图2。

二、去感觉神经抑制张力侧牙周膜内成骨标志物OCN的表达

牙移动组大鼠张力侧牙周膜中OCN的表达高于对照组，表明张力侧成骨活动增强。而去神经+牙移动组大鼠牙周膜中OCN的表达无明显变化。两因素间的交互效应有统计学意义（F = 6.669，P = 0.016），因此分析单独效应，结果显示牙移动组大鼠张力侧牙周膜中OCN蛋白表达高于去神经+牙移动组大鼠（t = 3.721，P = 0.001）;去神经组大鼠OCN蛋白表达与去神经+牙移动组大鼠比较差异无统计学意义（t = 0.462，P = 0.648），见图3。

讨论

本研究初步探讨了外周感觉神经和Wnt信号通路在OTM中的作用，结果显示OTM过程中Wnt5a表达上调，但去除感觉神经后Wnt5a表达受到抑制，表明感觉神经可能通过Wnt5a调控OTM骨改建过程。

Wnt5a和Wnt10b与机械力诱导的骨形成密切相关。MC3T3-E1受3400微应变处理5 h后，Wnt10b、SFRP1、cyclin D1、FzD2、WISP2和connexin 43基因的表达增加[13]。单轴机械张力可通过Wnt5a/Wnt5b/JNK信号通路促进大鼠肌腱干细胞的成骨分化[14]。因此，本研究选择了Wnt5a和Wnt10b进行研究。

文献报道，感觉神经对骨改建起着重要作用，但是其分子机制尚不明确[2]。本研究显示，去除感觉神经以后，OTM不能上调Wnt5a的表达，且牙移动和去感觉神经之间存在交互效应，提示感觉神经可能通过Wnt5a调控OTM的骨改建过程。但骨改建过程中感觉神经如何调控Wnt5a的表达尚未明确。CGRP和P物质都是感覺神经重要的分泌物，它们都具有促进成骨分化和骨形成的作用[2]。用CGRP处理骨髓间充质干细胞后，Wnt信号通路相关分子发生明显上调[8]。10-10 ～ 10-8 mol/L的P物质可以促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，这种促进作用可被DKK1抑制，表明P物质通过Wnt信号通路促进成骨分化[15]。以上结果提示感觉神经有可能通过CGRP和P物质调控Wnt5a的表达，我们将在日后的工作中进一步研究。

另外，本研究还发现去除感觉神经会影响张力侧成骨标志物OCN的表达水平，去神经后牙周膜张力侧OCN的表达不再随着OTM的进行而上调，但Wnt5a如何调控骨的形成也有待于进一步研究。近年文献报道，Wnt5a在成骨过程中可以激活经典的Wnt/β-catenin信号通路。Wnt5a可能通过Wnt/β-catenin调控成骨过程[16]。

综上所述，外周感觉神经可能通过Wnt5a调控OTM过程中的骨改建活动。本研究丰富了正畸的基础理论，为快速安全地进行正畸治疗提供了研究方向，有望减少长时间正畸治疗带来的不良反应[17]。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-09-10）

（本文編辑：林燕薇）