HCBP6在原发性胆汁性胆管炎患者中的表达及意义

高丽丽?张亦瑾?高学松?李洪杰?刘楠?高萍?徐琍?段雪飞

【摘要】目的 探讨HCBP6在原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者中的表达及意义。方法 收集PBC患者血清标本60例（PBC血清组）、取10名同期健康体检者外周血标本为正常对照组1，采用ELISA法检测血清HCBP6水平。收集肝穿刺标本40例（PBC肝组织组）、取10例肝移植供肝组织标本作为正常对照组2，采用免疫组织化学染色检测肝组织HCBP6表达，分析HCBP6与肝组织病理分期的相关性。结果 PBC血清组HCBP6水平较正常对照组1低（P < 0.05）。PBC肝组织组中的HCBP6阳性细胞数量较正常对照组2少（P < 0.01），与肝组织病理分期呈负相关（rs = -0.583，P < 0.001）。结论 HCBP6在PBC患者外周血和肝组织中均呈低表达，提示HCBP6可能在PBC的发病过程中发挥重要作用。

【关键词】HCBP6;原发性胆汁性胆管炎;病理分期

Expression and clinical significance of HCBP6 in patients with primary biliary cholangitis Gao Lili， Zhang Yijin， Gao Xuesong， Li Hongjie， Liu Nan， Gao Ping， Xu Li， Duan Xuefei. Department of General Med-icine， Beijing Ditan Hospital， Capital Medical University， Beijing 100015， China

Corresponding author， Duan Xuefei， E-mail： duanxuefei@ vip. sina. com

【Abstract】Objective To investigate the expression and clinical significance of hepatitis C virus core-binding protein 6 （HCBP6） in patients with primary biliary cholangitis（PBC）. Methods A total of 60 serum specimens from PBC patients （PBC serum group） and 10 peripheral blood specimens from healthy subjects （normal control group 1）were collected. The level of serum HCBP6 was determined by ELISA. Forty liver tissue specimens from PBC patients （PBC liver tissue group）via liver biopsy and 10 normal donor liver specimens from liver transplantation （normal control group 2）were collected. The expression level of HCBP6 in the liver tissues was detected by immunohistochemistry. The correlation between HCBP6 and the pathological staging of liver tissues was analyzed. Results The level of serum HCBP6 in the PBC serum group was significantly down-regulated than that in the normal control group 1（P < 0.05）. The quantity of HCBP6-positive cells in liver tissues of PBC liver tissue group was significantly less compared with that in the normal control group 2 （P < 0.01）. It was nagatively correlated the pathological staging （rs = -0.583，P < 0.001）. Conclusion HCBP6 is lowly expressed in the peripheral blood and liver tissues of PBC patients， prompting that HCBP6 probably plays a pivotal role in the pathogenesis of PBC.

【Key words】Hepatitis C virus core-binding protein 6;Primary biliary cholangitis;

Pathological staging

原發性胆汁性胆管炎（PBC）又称原发性胆汁性肝硬化，是一种由自身免疫介导的慢性肝病，中老年女性为好发人群。临床上以慢性胆汁淤积、血清抗线粒体抗体（AMA）阳性、IgM升高、肝脏生化指标异常为特征，病理上主要表现为肝内小胆管进行性非化脓性破坏性炎症，可慢性进展至肝纤维化，最终导致肝硬化[1]。关于PBC的发病机制，目前没有定论，除遗传、环境等因素以外，多种免疫细胞、细胞因子、基因均参与了疾病的发生。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6（HCBP6）又名FUNDC2、HCC3、DC44 PD03104，是由我们课题组通过酵母双杂交技术筛选并命名的一个基因。其可以与丙型肝炎病毒核心蛋白结合，生物学功能尚不十分明确[2]。课题组初步的研究表明，HCBP6在甘油三酯代谢过程中发挥重要作用[3]。近期有研究认为代谢综合征在PBC的发病及疾病进展中发挥重要作用，提示与甘油三酯代谢密切相关的HCBP6可能在PBC的发病及疾病进展中发挥重要作用[4]。本研究主要检测PBC患者与正常对照者之间血清和肝组织中HCBP6的表达差异，分析HCBP6与临床相关指标、肝组织的病理分期之间的关系，进而阐述HCBP6在PBC发生发展中可能的作用。

对象与方法

一、研究对象

选取2015年1月至2019年1月首都医科大学附属北京地坛医院确诊的PBC患者60例。PBC的诊断主要依据2018年美国肝病研究学会（AASLD） 更新的PBC诊断和治疗指南，需符合3项诊断标准中的2项：AMA阳性;提示胆汁淤积的生化学表现;组织学表现为非化脓性破坏性胆管炎和小叶间胆管损伤[5]。排除合并其他自身免疫性肝病、系统自身免疫性疾病、各种急慢性病毒性肝炎、半年内使用可疑肝损伤药物、长期大量饮酒及临床资料不完整者。60例PBC患者外周血标本作为PBC血清组，另选取10名同期健康体检者外周血标本作为正常对照组1。

选取2015年1月至2019年1月首都医科大学附属北京地坛医院PBC患者肝穿刺标本40例（PBC肝组织组），PBC患者入组标准及排除标准同上。病理分期主要依据Scheuer评分系统：小胆管炎期为Ⅰ期，细小胆管增生期为Ⅱ期，瘢痕期为Ⅲ期，肝硬化期为Ⅳ期[6]。各病理分期PBC患者各10例，另选同期10名肝移植供肝组织的肝穿刺标本为正常对照组2。研究方案获首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

二、方 法

1.主要试剂

用于ELISA的试剂盒购自武汉艾伯维公司，兔抗人HCBP6抗体购自台湾Anova公司，Dako REAL EnVision 免疫组化检测试剂盒购自美国Dako公司。

2. ELISA法测定血清HCBP6水平

PBC血清组、正常对照组1的外周静脉血5 ml，2 h内1000 ×g离心10 min，取上层血清，并保存于-80℃，依据ELISA试剂盒的方法检测血清HCBP6的表达水平，具体步骤参照试剂盒说明书。

3.肝组织HCBP6免疫組织化学（组化）染色

PBC肝组织组、正常对照组2的肝组织标本用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，以4 μm厚连续切片，以二甲苯、乙醇梯度脱蜡。磷酸盐缓冲液洗涤3次，由3% H2O2作用15 min以消除内源性过氧化物酶活性。再由柠檬酸盐缓冲液热修复15 min，自然缓慢冷却至室温。由羊血清在室温下封闭30 min后滴加兔抗人HCBP6抗体（浓度为1∶100），4℃过夜。次日再滴加二抗，经二氨基联苯胺显色后苏木精复染，然后中性树胶封片。最后在显微镜下（×400）随机选取5个门管区，主要计数每个门管区的阳性细胞数量，取平均值进行统计学分析。免疫组化评分标准见表1。

表1              肝组织标本免疫组化评分标准

项 目 0 1 2 3

阳性细胞比例（%） 0% < 30% 30% ～ 70% > 70%

染色强度 阴性 弱 中 强

注：总分为阳性细胞比例的得分加上其免疫组化染色强度的得分，即得到其总分为0、2、3、 4、5或6;0 为（-），2为（+），3 ～ 4为（++），5 ～ 6 为（+++）

三、统计学处理

统计学分析采用SPSS 17.0。计量资料以表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料采用百分比表示，组间比较采用Fisher确切概率法。等级资料间的相关性采用Spearman秩相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般资料比较

PBC血清组共60例，其中男6例、女54例，年龄 （46.8±8.8）岁;正常对照组1共10例，男2例、女8例，年龄 （50.2±9.6）岁。PBC血清组与正常对照组1的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。

PBC肝组织组40例，其中男5例、女35例，年龄 （43.0±10.5）岁。Ⅰ期10例，其中男1例、女9例，年龄（30.5±11.7）岁。Ⅱ期10例，其中男2例、女8例，年龄（40.2±10.6）岁。Ⅲ期10

例，其中男1例、女9例，年龄（39.6±12.8）岁。Ⅳ期10例，其中男1例、女9例，年龄（41.4± 8.4）岁。正常对照组2共10名，其中男2名、女8名，年龄 （32.3±12.6）岁。PBC肝组织各分期组之间与正常对照组2的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。

二、PBC血清组与正常对照组1的HCBP6水平表达比较

PBC血清组HCBP6水平比正常对照组1低（t = 6.815，P < 0.001），见图1。

三、PBC肝组织各分期组与正常对照组2的临床特征、肝组织HCBP6表达差异及其与病理分期的相关性

与正常对照组相比，PBCⅠ期、PBCⅡ期、PBCⅢ期、PBCⅣ期的白蛋白、甘油三酯差异均有统计学意义（P均< 0.05）;PBCⅠ期、PBCⅢ期、PBCⅣ期血小板差异均有统计学意义（P均< 0.05）;PBCⅢ期、PBCⅣ期胆红素、总胆固醇差异均有统计学意义（P均< 0.05）。与PBCⅠ期相比，PBCⅡ期、PBCⅢ期总胆固醇、甘油三酯差异均有统计学意义（P均< 0.05）;PBCⅢ期、PBCⅣ期白蛋白差异均有统计学意义（P均< 0.05）;PBCⅣ期胆红素差异有统计学意义（P < 0.05）。PBCⅡ期相比，PBCⅣ期甘油三酯差异有统计学意义（P< 0.05），见表2。

免疫组化的染色结果显示，HCBP6阳性染色主要定位于肝细胞的细胞质，呈棕褐色，细胞核中有少量染色。PBC患者中HCBP6阳性的细胞较正常肝组织明显减少，正常对照组2与PBC肝组织各分期组间HCBP6阳性细胞数量比较差异均有统计学意义（P均< 0.01），见图2、表3。秩相关分析显示，HCBP6阳性细胞数量与肝组织病理分期呈负相关（rs = -0.583，P < 0.001）。

討论

原发性胆汁性肝硬化是一种自身免疫介导的慢性进行性胆汁淤积性肝病，其病理特征为慢性进行性小叶间胆管的破坏性炎症改变，同时伴随小胆管增生，肝内结缔组织增生，最终形成肝硬化。其主要临床表现为门脉高压和肝功能衰竭[7]。

关于PBC的发病原因，目前大多学者认为与自身免疫反应相关，遗传因素是主要的决定因素。另外雌激素、性染色体、泌尿道或阴道感染及环境因素也是重要的发病因素[8-16]。目前有研究认为代谢综合征在PBC的发病及疾病进展中发挥重要作用[4]。而甘油三酯代谢异常是引发代谢综合征的重要因素，所以甘油三酯的代谢异常在PBC的发病和疾病进展中有可能起到重要作用。我们的初步研究表明HCBP6可下调甘油三酯，并随甘油三酯的升高而上调[3]。提示我们HCBP6可能在PBC的发病及病程进展中起重要作用。而我们的本次研究证实了这个观点。通过比较健康人与PBC患者血清及组织中HCBP6的表达量，我们发现PBC患者中HCBP6的含量明显下降，提示HCBP6可能参与了PBC的发病。

关于代谢综合征在PBC发病及进展中的机制尚无相关研究。那HCBP6在PBC发病中的作用机制又是怎样的呢？近期美国和意大利合作开展了一项多中心的研究给了我们一些提示[17]。这项研究选择同卵双胞胎，而在双胞胎中一个患有PBC，另一个没有PBC，利用全基因组研究分析2组的基因组，结果发现HCBP6的启动子甲基化与PBC的发病相关。而近期Gershwin团队的研究又证实了上述结论，他们认为PBC患者中CD8+ T淋巴细胞的HCBP6启动子存在高甲基化状态，并且这种高甲基化与PBC的发病相关[18]。这都提示我们HCBP6在PBC的发病中的作用机制可能是启动子的甲基化，这将是我们下一步的研究内容。

综上所述，HCBP6可能在PBC的发病过程中发挥重要作用，然而其作用机制是否为通过启动子甲基化，目前尚待进一步研究。

参 考 文 献

[1] 王璐，常英昊，韩英. 原发性胆汁性胆管炎的发病机制及治疗进展. 国际消化病杂志，2019，39（2）：81-85.

[2] 李克，王琳，成军，张玲霞，段惠娟，陆荫英，杨继珍，刘妍，夏小兵，王刚，董菁，李莉，钟彦伟，洪源，陈菊梅. HCV核心蛋白结合蛋白基因6的克隆. 中华实验和临床病毒学杂志，2002，16（4）： 351-353.

[3] Gao LL， Li M， Wang Q， Liu SA， Zhang JQ， Cheng J. HCBP6 modulates triglyceride homeostasis in hepatocytes via the SRE-BP1c/FASN pathway. J Cell Biochem，2015，116（10）：2375-2384.

[4] Híndi M， Levy C， Couto CA， Bejarano P， Mendes F. Primary biliary cirrhosis is more severe in overweight patients. J Clin Gas-troenterol，2013，47（3）： e28-e32.

[5] 王璐， 韩英. 《2018年美国肝病学会原发性胆汁性胆管炎实践指导》摘译. 临床肝胆病杂志， 2018， 34（11）：44-48.

[6] Scheuer P. Primary biliary cirrhosis. Proc R Soc Med， 1967， 60 （12）： 1257-1260.

[7] Kaplan MM， Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med，2005，353（12）： 1261-1273.

[8] Stinton LM， Swain M， Myers RP， Shaheen AA， Fritzler MJ. Autoantibodies to GW bodies and other autoantigens in primary biliary cirrhosis. Clin Exp Immunol，2011，163（2）： 147-156.

[9] Chen RR， Han ZY， Li JG， Shaheen AA， Fritzler MJ. Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 gene +49A/G polymorphism significantly associated with susceptibility to primary biliary cirrhosis： a meta-analysis. J Dig Dis，2011，12（6）：428-435.

[10] Selmi C， Maria PA， Pugliese P， Claudia AM， Gershwin ME. Environmental pathways to autoimmune diseases： the cases of primary biliary cirrhosis and multiple sclerosis. Arch Med Sci，2011，7（3）： 368-380.

[11] Mitchell MM， Lleo A， Zammataro L， Mayo MJ， Invernizzi P， Bach N， Shimoda S， Gordon S， Podda M， Gershwin ME， Selmi C， LaSalle JM. Epigenetic investigation of variably X chromosome inactivated genes in monozygotic female twins discordant for primary biliary cirrhosis. Epigenetics，2011，6 （1）： 95-102.

[12] Invernizzi P. Human leukocyte antigen in primary biliary cirrh-osis： an old story now reviving. Hepatology，2011，54（2）： 714-723.

[13] Tanaka A， Invernizzi P， Ohira H， Kikuchi K， Nezu S， Kosoy R， Seldin MF， Gershwin ME， Takikawa H. Replicated association of 17q12-21 with susceptibility of primary biliary cirrhosis in a Japanese cohort. Tissue Antigens，2011，78（1）： 65-68.

[14] Smyk DS， Rigopoulou EI， Muratori L， Burroughs AK， Bogdanos DP. Smoking as a risk factor for autoimmune liver disease： what we can learn from primary biliary cirrhosis. Ann Hepatol，2012，11（1）： 7-14.

[15] Bournia VK， Vlachoyiannopoulos PG. Subgroups of Sj?gren syndrome patients according to serological profiles. J Auto-immun，2012，39（1-2）： 15-26.

[16] Tunccan OG， Tufan A， Telli G， Akyürek N， Pamuk?uo?lu M， Y?lmaz G， H?zel K. Visceral leishmaniasis mimicking autoimmune hepatitis， primary biliary cirrhosis， and systemic lupus erythematosus overlap. Korean J Parasitol，2012，50（2）： 133-136.

[17] Selmi C， Cavaciocchi F， Lleo A， Cheroni C， De Francesco R， Lombardi SA， De Santis M， Meda F， Raimondo MG， Crotti C， Folci M， Zammataro L， Mayo MJ， Bach N， Shimoda S， Gordon SC， Miozzo M， Invernizzi P， Podda M， Scavelli R， Martin MR， Seldin MF， Lasalle JM， Gershwin ME. Genome-wide analysis of DNA methylation， copy number variation， and gene expression in monozygotic twins discordant for primary biliary cirrhosis. Front Immunol，2014，5： 128.

[18] Lleo A， Zhang W， Zhao M， Tan Y， Bernuzzi F， Zhu B， Liu Q， Tan Q， Malinverno F， Valenti L， Jiang T， Tan L， Liao W， Coppel R， Invernizzi P， Lu Q， Adams DH， Gershwin ME; PBC Epigenetic Study Group. DNA methylation profiling of the X chromosome reveals an aberrant demethylation on CXCR3 promoter in primary biliary cirrhosis. Clin Epigenetics，2015，7：61.

（收稿日期：2019-08-06）

（本文編辑：杨江瑜）