水飞蓟宾对B16细胞生长、酪氨酸酶活性及黑色素合成等的影响

文/吴依蒙 通讯作者/吴英良

前言

水飞蓟作为治疗肝病的植物药已经有两千多年历史[1]，水飞蓟宾作为其主要活性成分之一，近年来广泛应用于治疗肝炎、肝硬化及代谢中毒性肝损伤等疾病，大量的临床研究发现，水飞蓟宾还具有抑制前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌等作用[2]，同时还具有抗氧化、清除自由基和抑制UV 诱导的皮肤炎症等作用[3-4]。本文以小鼠黑色素瘤B16细胞为研究对象，考察检测水飞蓟宾对细胞的形态、增殖、迁移、克隆、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）活性以及黑色素合成量等方面的影响，为相关的临床应用提供实验依据。

仪器与材料

B16 细胞，中国科学院上海生命科学院；RPMI-1640 培养液，康宁公司；胰蛋白酶/EDTA 消化液，批号：20180120-0222，天津灏洋；MTT，批号：804W056，北京索莱宝；Triton X-100，批 号：0694，Amresco；熊果苷（＞98%），批号：A0310A，美伦生物；L-dopa，批号：O0502A，美伦生物；水飞蓟宾（HPLC 测定纯度99%），江苏镇江句容市倍思特医药材料有限公司合成；ELx808 全自动酶标仪，美国伯腾；1300 系列Ⅱ级A2 型生物安全柜，赛默飞世尔（苏州）；AE2000 倒置生物显微镜，Motic；ULTS1368低温冰箱，赛默飞世尔（苏州）；TDZ5-WS 型离心机，湘仪集团；HH-ZK2 恒温水浴锅，予华仪器。

方法

1.细胞培养

B16细胞用RPMI-1640完全培养基（含体积分数为10%的胎牛血清）于37 ℃，5% CO2（培养箱内空气中CO2的体积分数为5%）条件下培养。

2.MTT 比色法检测细胞增殖率

取指数生长期的B16 细胞，经消化分散制备为单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔0.8×104个的细胞密度接种于96 孔板，培养12 h，待细胞完全贴壁，弃去上清液，每孔加入100 μl 不同浓度的加药培养基（水飞蓟宾浓度分别为60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml），DMSO体积分数小于0.5%。每个浓度设置3 个复孔，对照组加入新鲜培养液代替药物溶液，培养72 h。弃去上清液，每孔加入含有5 g/L MTT 的培养液100 μl，继续培养4 h。弃去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震荡10 min。于酶标仪测定各孔在490 nm下的吸光度（OD）值[5]。细胞增殖率按以下公式计算：细胞增殖率=（实验孔OD 值－空白孔OD 值）/（对照孔OD值－空白孔OD 值）×100%。

3.细胞形态观察

将B16 细胞以每孔3×104个的细胞密度接种于6 孔板，培养箱中培养贴壁后每孔分别加入不同浓度的加药培养基（水飞蓟宾浓度80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml），对照组加入普通培养液，继续培养48 h 后置于显微镜下观察对照组和实验组的细胞大小、形态、生长密度及融合状态等，拍照记录。

4.对B16 细胞迁移活动的影响

取指数生长期的B16 细胞，以每孔3×104个的细胞密度接种于6 孔板，待细胞生长到融合度达90%～95% 时用枪头在6 孔板底部划线，DPBS 清洗3 次确保没有松散细胞粘连。分别加入不同浓度的加药培养基（水飞蓟宾浓度80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml）， 对照组加入新鲜培养液代替药物溶液，20 h后显微镜下用相机拍照。

5.对B16 细胞克隆形成的影响

取指数生长期的B16 细胞，以每孔3×104个的细胞密度接种于6 孔板，培养12 h，待细胞完全贴壁，弃去上清培养液，每孔分别加入不同浓度的加药培养基（水飞蓟宾浓度80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml），每个浓度设置3 个复孔，对照组加入新鲜培养液代替药物溶液。培养48 h，取药物作用后的细胞调整成细胞悬液，以1×103个/皿培养21 天，用结晶紫染色，记录拍照[6]。

6.对B16 细胞内酪氨酸酶活性的影响

细胞培养和实验处理同2，每孔分别加入100 μl 不同浓度的加药培养基（水飞蓟宾浓度分别为30 μg/ml、15 μg/ml、7.5 μg/ml），每个浓度设置3 个复孔，对照组加入浓度为80 μg/ml 的熊果苷，培养72 h。弃去上清液，DPBS 清洗两次，每孔加入含1% TritonX-100 的DPBS缓冲液80 μl，迅速置于-80℃低温冰箱2 h。取出置于常温融化，37℃孵育5 min，加入20 μl 质量分数为0.2%的L-dopa，37℃反应2 h，于酶标仪测定490 nm 的吸光度值。按如下公式计算酶活力：酪氨酸酶活性=实验组OD 值/对照组OD 值×100%

7.对黑色素合成量的影响

取指数生长期的细胞，调整细胞密度以每孔3×104个接种于6 孔板，12 h 后弃去上清液，加入药液（浓度同6），设置3 个复孔。培养72 h 后，用DPBS清洗2 次，消化并收集细胞于离心管中（共2 ml，其中取20 μl 稀释一定倍数用于细胞计数），于1500 r/min 的条件下离心10 min，弃去上清液。加入2 ml的DPBS 用移液器轻轻吹打制成细胞悬液，加入500 μl 乙醇乙醚混合液（体积比1 ∶1），在室温下放置30 min，于3000 r/min 的条件下离心5 min，弃去上清液，加入1 ml 含10%DMSO的1 mol/L NaOH 溶液，小心混匀，于80℃水浴孵育45 min，测定490 nm 吸光度值。黑色素合成总量=（实验组OD值/对应细胞数）/（对照组OD 值/对应细胞数）×100%

8.数据分析

实验数据采用SPSS 16.0 统计软件进行统计分析，结果用平均值±标准差表示，并且认为P ＜0.05 时差异具有统计学意义。

结果

1.水飞蓟宾对B16 细胞的增殖影响

利用MTT 法检测不同浓度水飞蓟宾（7.5 μg/ml、15 μg/ml、30 μg/ml、60 μg/ml）对B16 细胞增殖的影响（表1），与对照组相比，高浓度（60 μg/ml）水飞蓟宾对B16 细胞具有显著抑制作用，浓度为30 μg/ml、15 μg/ml 时，对细胞有一定的增殖促进作用（但15 μg/ml浓度组与对照组相比无显著差异），药液浓度为7.5 μg/ml，细胞增殖率与对照组差异不大。

2.水飞蓟宾对B16 细胞生长形态的影响

在倒置显微镜下观察细胞在不同浓度药物作用下的生长情况（图1），对照组细胞生长良好，形态正常；水飞蓟宾浓度为80 μg/ml 时，细胞数量明显减少，有较多漂浮死亡；浓度为40 μg/ml 时，细胞数量减少，形态成长梭形，与对照组相比变化明显；浓度为20 μg/ml 时，细胞数量、形态与对照组基本无区别。

图1 水飞蓟宾对B16 细胞生长形态的影响（x200）

图2 水飞蓟宾对B16 细胞迁移活动的影响（x40）

图3 水飞蓟宾对B16 细胞克隆形成的影响

表1 水飞蓟宾对B16 细胞的增殖影响

表2 水飞蓟宾对B16 细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成量的影响

3.对B16 细胞迁移活动的影响

采用划痕愈合实验检测水飞蓟宾对B16 细胞的迁移及浸润能力的影响（图2），结果显示水飞蓟宾能抑制B16 细胞的迁移，且有剂量依赖性。

4.对B16 细胞克隆形成的影响

由图3可看出，水飞蓟宾作用于B16 细胞一定时间后，重新用普通培养液进行细胞克隆实验，依然有一定的抑制克隆的作用，且具有剂量依赖性。

5.水飞蓟宾对B16 细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响

不同浓度水飞蓟宾对B16 细胞内酪氨酸酶活性实验发现，水飞蓟宾浓度为7.5 μg/ml 、15 μg/ml、30 μg/ml 时，对酪氨酸酶活性均有明显的促进作用（P ＜0.01），与对照组相比酪氨酸酶活性随浓度升高而增强，但是对细胞内黑色素合成的含量无明显影响。

讨论与结论

水飞蓟宾被广泛应用于治疗肝炎、肝硬化及代谢中毒性肝损伤等疾病[7]，根据其抗炎、抗自由基、降胆固醇等多种药理作用，临床还将其与瑞舒伐他汀等降血脂药物联用治疗不稳定心绞痛等疾病[8]。本研究证明了水飞蓟宾除抑制前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌等作用外[9]，对小鼠黑色素瘤B16 细胞的生长、增殖、迁移、克隆等也有抑制作用，且发现水飞蓟宾在浓度7.5～30 μg/ml 时能显著增加B16 细胞内酪氨酸酶的活性，但对黑色素合成量无明显影响。黑色素生物合成主要发生于黑色素细胞中的黑色素小体，以酪氨酸为底物，在酪氨酸酶的作用下合成黑色素。而细胞内酪氨酸酶在黑色素合成过程中活性不是一成不变的[10]，酪氨酸酶从核内的转运过程以及与黑素小体的膜融合受溶酶体相关细胞器生物合成复 合 物（BLOC-1，2，3） 等 影 响[11]。黑色素小体的形成、发展和代谢等也与多种因素有关[12-14]。本研究中水飞蓟宾能促进酪氨酸酶活性却不影响黑色素合成量，可能是由于合成黑色素的其他条件所导致。酪氨酸酶来源于胚胎神经鞘细胞，是黑色素代谢的关键酶[15]和白癜风自身免疫的重要抗原。水飞蓟宾作为一种安全、低毒、低副作用的天然药物，迄今为止尚未发现有急、慢性毒性，基因毒性等案例发生[16]。在欧美，一种含80%水飞蓟素的乳蓟提取物甚至已作为防癌的食品添加剂上市[17]。有报道还认为根据其一定的抗菌、抗粘连作用，可以考虑将其作为膳食补充剂[18]。利用水飞蓟宾同时具有的抗肿瘤及促进酪氨酸酶活性的药理作用，可进一步研究发掘其在酪氨酸酶活性相关疾病，如白癜风病或白化病中的作用，并为相关药物临床联用提供实验依据。