蛴螬提取物对视网膜中央静脉阻塞模型兔小胶质细胞CD68表达的影响及机制研究*

蒋鹏飞，董子奕，彭俊，马俊旭，梁凯霞，彭清华

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.天津市人民医院 眼科，天津 300121；3.湖南中医药大学第一附属医院 眼科，湖南 长沙 410007）

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）病程冗长，治疗困难，尚无特效疗法，视网膜新生血管是RVO的常见并发症。文献记载蛴螬可治疗目疾，并有破血、行瘀、散结及明目的功效，前期研究发现蛴螬提取物可促进RVO出血的吸收，抑制视网膜新生血管[1-2]。为明确其机制，本文通过复制RVO动物模型，探讨蛴螬提取物对视网膜新生血管的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用40只健康实验性兔，雌雄兼用，体重1.8～2.3 kg（合格证号：湘医动字第30-015号）。蛴螬提取物制备参考阳长明等[3]的方法。复方血栓通片（扬州中惠制药有限公司），一抗为兔抗白细胞分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）多克隆抗体（武汉博士德公司），二抗为生物素标记的IgG（武汉博士德公司）。

1.2 设备

电子秤（JY0001，上海天平仪器厂），勒克斯照度计（ZDS-10，上海嘉定学联仪器厂），眼科手术显微镜（YZZOT，苏州医疗器械设备厂），PCR仪（德国Biometra公司），凝胶成像系统（Gel Doc XR+，美国Bio-Rad公司），微量移液器（德国Eppendorf公司），垂直板电泳槽（DYCZ-24D，北京六一仪器厂），台式高速冷冻离心机（美国赛默飞公司），水平电转槽（DYCP-40C，北京六一仪器厂），超纯水仪（美国Millipore公司），紫外可见分光光度计（SP-752，上海Spectrum公司），恒温摇床（THZ-82A，金坛华特实验仪器有限公司），水平摇床（WD-9405B，北京六一仪器厂），扫描仪（9000F MarkⅡ，日本Canon公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组将40只实验性兔依次编为1～40号，通过随机数字表法，从第3行第5个数开始抄录40个数，将这些数字除以4，余数为1作为空白组，余数为2作为模型组，余数为3作为复方血栓通组，余数为0作为蛴螬组，最终每组10只动物，20只眼。

1.3.2 动物模型的复制应用光化学动力法复制实验性RVO模型，模型组、复方血栓通组及蛴螬组兔双眼散瞳后，麻醉动物，固定于裂隙灯前，安置三面镜；激光器指示光斑定位于视盘边缘的静脉后，自耳缘静脉缓慢推入20%荧光素钠注射液（0.3 ml/kg），30 s内推完。注药后，照射双侧视网膜静脉，同时避开伴行的动脉，有明显的远端静脉扩张时停止[4]。

1.3.3 动物给药空白组、模型组以生理盐水5 ml/kg灌胃；复方血栓通组：复方血栓通0.1 g/kg溶于生理盐水制成混悬液，5 ml/kg灌胃；蛴螬组：蛴螬提取物1.5 ml/kg灌胃。各组均为1次/d，持续至模型复制后3周，各组于模型复制后1、3、7、14及28 d随机处死2只动物。

1.3.4 取材动物耳缘静脉注射空气处死后，立即摘除眼球（包括球后视神经2 mm），于角膜缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节组织和玻璃体，手术显微镜下剥离眼球壁激光斑部位的视网膜，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视乳头颞侧旁开1 mm纵向做4μm厚的切片，烘干备用。

1.3.5 荧光素眼底血管造影术（fluorescein fundus angiography，FFA）模型复制后7、14及28 d对兔行FFA检查，将FFA结果输入Mias-2000型显微图像分析系统自动测量无灌注区和视盘的面积，并求出其比值[5]。分为无灌注区、有灌注区、无新生血管（甲类）、有新生血管（乙类）。

1.3.6 免疫组织化学法将取材的切片行苏木精-伊红染色，检测CD68的表达。一抗为兔抗CD68多克隆抗体，二抗为生物素标记的IgG，在光学显微镜下观察视网膜组织的变化。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组无灌注区与视盘面积比值比较

给药7 d后，模型组中央静脉荧光渗漏、出血，出现无灌注区，尚无新生血管出现；复方血栓通组和蛴螬组出现无灌注区，但渗漏、出血较模型组少。给药28 d后，模型组渗漏、出血的静脉周围无灌注区面积增大，并出现新生血管；复方血栓通组渗漏、出血明显减少；蛴螬组渗漏、出血基本吸收。复方血栓通组、蛴螬组与模型组给药后7、14及28 d的无灌注区与视盘面积比值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的无灌注区与视盘面积比值比较，差异有统计学意义（F=28.862，P=0.000）；②3组无灌注区与视盘面积比值比较，差异有统计学意义（F=53.221，P=0.000）；③3组无灌注区与视盘面积比值变化趋势比较，差异无统计学意义（F=0.622，P=0.737）。见表1。

2.2 各组CD68的表达水平比较

空白组视神经小胶质细胞均表现为无表达或极少量表达（见图1A）。模型组1 d时小胶质细胞增多（见图1B），3 d时小胶质细胞数量达最高峰（见图1C），7、14及28 d时小胶质细胞数量较前依次减少，28 d时多转变为杆状的静止状态（见图1D～F）。复方血栓通组小胶质细胞1 d时即有活化表现，3 d时活化达高峰（见图2A～E）。蛴螬组小胶质细胞在1 d时同样表现出了活跃的小胶质细胞，3 d时即表现出小胶质细胞受抑制，28 d时接近正常水平（见图2F～I）。复方血栓通组、蛴螬组与模型组在1、3、7、14及28 d的CD68表达水平比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点CD68表达水平比较，差异有统计学意义（F=21.373，P=0.000）；②3组CD68表达水平比较，差异有统计学意义（F=92.425，P=0.000）；③3组CD68表达的变化趋势比较，差异无统计学意义（F=0.743，P=0.569）。见表2。

表1 各组不同时间无灌注区与视盘面积比值比较 （n =2，±s）

表1 各组不同时间无灌注区与视盘面积比值比较 （n =2，±s）

组别眼数7 d14 d28 d模型组416.34±3.5117.72±2.2019.42±2.69复方血栓通组411.88±2.148.22±1.974.18±1.75蛴螬组49.78±1.876.26±1.952.90±1.50

图1 空白组和模型组不同时间小胶质细胞CD68的表达 （光学显微镜×400）

图2 复方血栓通组和蛴螬组不同时间小胶质细胞CD68的表达 （光学显微镜×400）

表2 各组CD68表达水平比较 （n =2，±s）

表2 各组CD68表达水平比较 （n =2，±s）

组别眼数1 d3 d7 d14 d28 d空白组4194.06±9.37196.26±10.78191.12±2.44197.72±4.29194.96±3.21模型组4142.80±8.6985.90±5.01114.36±10.21144.86±6.24164.08±5.59复方血栓通组4146.16±8.26108.56±8.41128.54±9.63168.48±8.24182.56±4.88蛴螬组4143.18±3.53125.72±4.90160.78±6.34186.20±3.69197.42±2.21

3 讨论

RVO发病率高，是仅次于糖尿病视网膜病变的第二大致盲性视网膜血管病，其发生机制目前尚不明了[6-11]。蛴螬是金龟子的幼虫，首次记载于《神农本草经》：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤，青翳白膜。”《晋书》中有此药治疗目疾的记载：“吴中书郎战冲，母王氏失明，婢取蛴螬蒸熟与食，王以为美，冲还知之，抱母恸哭，母目即开。”《本草纲目》中记载此药味咸微温，有破血、行瘀、散结、通乳、解毒、消疮及明目的功能。现代药理研究认为蛴螬对RVO的缺血视网膜组织有保护作用，能够治疗RVO所致的视网膜病理损伤[1-2]。

随着视网膜作为免疫赦免区概念的打破，越来越多的学者开始研究小胶质细胞在视网膜疾病中的活化及作用，尤其是小胶质细胞的活化在RVO的相关研究中取得了一定的进展[12-14]。RVO时，组织出现缺血缺氧改变，小胶质细胞会迅速活化并趋附在损伤组织周围。大量研究发现，视网膜上持续活化的小胶质细胞对视网膜神经元有损伤作用[15-18]。视网膜小胶质细胞的免疫组织化学表达较多，不同表达因子的选择对实验有一定影响[10，19-20]。本研究选取针对兔的CD68作为指标，CD68从形态上能很清楚地显示小胶质细胞形状的多样性。

本研究发现，蛴螬提取物与复方血栓通均可改善RVO后组织灌注情况，但蛴螬提取物较复方血栓通效果更好。对视网膜小胶质细胞活化的表达因子CD68的检测发现，复方血栓通和蛴螬提取物都使小胶质细胞的阳性表达随时间的延长而减弱，3 d后蛴螬组比复方血栓通组的阳性表达减少，说明蛴螬提取物不仅能抑制RVO后小胶质细胞的活化，而且比单纯的活血化瘀药能更快地发挥对小胶质细胞的抑制作用，这应该与蛴螬提取物的免疫抑制作用有关。