化脓性链球菌耐药与毒力基因研究

郑黎黎 徐燕,* 张卉 安宁 杨平玲

(1 日照市中心医院检验科，日照 276800；2 日照市人民医院内分泌科，日照 276800)

化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)亦称A链球菌群(group A streptococci)是急性扁桃体炎、急性咽炎重要病原菌之一。人感染化脓性链球菌后会出现人体的变态反应并可导致猩红热、风湿热和急性肾小球肾炎。所以对化脓性链球菌感染者进行早期而有效的治疗对预防上述疾病的发生十分有用。多年来, 有关化脓性链球菌对抗菌药物的敏感性研究较多[1-5]，但尚无该菌的毒力基因研究报道。本文从急性扁桃体炎、急性咽炎患者的咽喉部分离到70株化脓性链球菌，为探讨该菌的耐药与毒力基因存在状况, 我们进行了8种与耐药相关的元件基因(以下简称8种耐药基因)和3种毒力基因检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

70株化脓性链球菌分离自日照市中心医院2012—2017年急性扁桃体炎、急性咽炎患者的咽拭子标本。菌种均经VITEK 2细菌鉴定药敏分析仪鉴定。

1.2 抗菌药物的药敏试验

5种抗菌药物敏感性试验为K-B药敏纸片法。药敏纸片为英国Oxoid公司产品。

1.3 菌株DNA提取

化脓性链球菌菌体DNA制备为非离子去污剂裂解加蛋白酶K消化法。菌体DNA制备试剂盒由该无锡市克隆遗传技术研究所提供。挑取单个菌落放入菌体DNA制备试剂盒提供的裂解液A(非离子去污剂)与裂解液B(蛋白酶K)混合液中，然后60℃水浴100min，再用100℃水浴10min即可。

1.4 耐药与毒力基因检测

8种耐药基因和3种毒力基因检测均为PCR法。检测项目见表1。引物序列由无锡新吴区新克隆数据分析工作室提供，PCR试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供，实验步骤完全按说明书进行操作。每种PCR检测的反应系统均为重组的耐热DNA聚合酶(rTaq DNA pol，日本Takara公司产品)1个单位(体积0.2μL)，与重组的耐热DNA聚合酶配匹的10倍浓度缓冲液2μL；上游引物2μL(1.0μmol/L)，下游引物2μL(1.0μmol/L)；dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合液2μL(浓度均2mmol/L)；超纯水7μL，菌株DNA提取液4.8μL，合计总体积20μL。热循环为：95℃预变性2min，然后95℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，重复30周期，最后一轮72℃延长至5min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳30min，紫外线下凝胶上出现与阳性对照分子量相同的目的条带即判别为阳性。

表1 耐药与毒力基因检测PCR引物序列和目的产物长度Tab.1 PCR primers and the length of the target product of resistant determinants and virulence factors in 70 S.pyogenes

1.5 DNA序列检测分析

毒力基因的PCR阳性产物委托上海铂尚生物技术公司作DNA序列检测，测得序列后用Chromas软件在线作美国基因库BLASTn比对(www.ncbi.nlm.nih.gov)。

1.6 基于检测结果的样本聚类分析

对8种耐药基因和3种毒力基因检测结果委托无锡新吴区新克隆数据分析工作室作UPGMA法分析。

2 结果

2.1 抗菌药物的药敏试验

70株化脓性链球菌对青霉素、苯唑西林、万古霉素敏感性均达100.00%，对红霉素耐药率较高(94.29%)。70株化脓性链球菌药敏试验结果见表2。

2.2 耐药与毒力基因检测

70株化脓性链球菌经耐药基因检测，青霉素耐药基因无阳性结果发现。大环内酯类耐药基因检出ermB和mefA基因，其中ermB和/或mefA阳性66株，阳性率达94.29%。可移动遗传元件标志基因intTN916检出率高达94.29%。毒力基因检测则发现3种毒力基因均有较高的检出率。各种基因检测结果阳性率详见表3。图1～3为spyA、 sagA、slo PCR阳性产物测序图。

2.3 基于检测结果的指标样本聚类分析

对8种耐药基因和3种毒力基因检测结果作UPGMA法样本聚类分析，由图4可见，70株化脓性链球菌由分为A～N，共14个分类单元，并可分为Ⅰ、Ⅱ两个群，其中Ⅰ群由A、D、I、N、C、K、L、F、J等9个分类单元构成(该9个分类单元均携带ermB基因)，Ⅱ群由E、M、B、G、H等5个分类单元构成(5个分类单元均不携带ermB基因)。70株化脓性链球菌耐药与毒力基因检测结果经样本聚类分析，14个分类单元中各成员(菌株号)与阳性模式及占比见表4。

表2 70株化脓性链球菌药敏试验结果Tab.2 Result of drug sensitivity test of 70 S.pyogenes to 5 antimicrobial agents

表3 70株化脓性链球菌耐药与毒力基因检测阳性率Tab.3 Positive rates of resistance determinants and virulence factors in 70 S.pyogenes

3 讨论

图1 spyA PCR阳性产物测序图Fig.1 Part sequence of spyA

图2 sagA PCR阳性产物测序图Fig.2 Part sequence of sagA

图3 slo PCR阳性产物测序图Fig.3 Part sequence of slo

图4 70株化脓性链球菌的8种耐药基因和3种毒力基因检测结果样本聚类分析Fig.4 Sample cluster analysis of 8 kinds of resistant determiants and 2 kinds of virulence factors in 70 S.pyogenes

本文70株化脓性链球菌的抗菌药物药敏试验结果显示对青霉素、苯唑西林、万古霉素敏感性均达100.00%，其中青霉素的敏感率与先前国内的文献报道一致[1-4]，与国外的综述性报告亦一致[6]。本文70株化脓性链球菌没有检出青霉素耐药基因亦进一步佐证了药敏试验结果。本文菌株的红霉素耐药率极高(达94.29%)，与之相关的大环内酯类耐药基因检出ermB和mefA基因，况且ermB和/或mefA阳性达66株(阳性率达94.29%)，与本文菌株的红霉素耐药率完全一致。本文70株化脓性链球菌的红霉素高耐药率及ermB基因高检出率与来自国内北京与上海的报告一致[3-5]。国外的综述性报告中亦显示化脓性链球菌对红霉素耐药率高相吻合[6]。可见青霉素仍是治疗化脓性链球菌感染的首选药物。接合型转座酶基因intTN916是接合型转座子Tn916的遗传标志。接合型转座子Tn916介导球菌的获得性耐药基因, 是球菌的重要可移动遗传元件[7]。本文菌株intTN916检出率达94.29%，与ermB检出率92.86%大体一致。这是国内首次进行化脓性链球菌的intTN916检测报告。

化脓性链球菌具有多种类型的毒力因子，如:黏附毒素、细胞毒素、胞外酶、蛋白酶、DNA酶、免疫反应性抗原、超抗原以及免疫逃避机制。国内尚无上述毒力因子编码基因的检测研究报道。细胞毒素是化脓性链球菌的重要毒力因子, 本文检测了spyA、sagA和slo3种细胞毒素毒力因子编码基因(毒力基因)。spyA基因编码一种新的ADP-核糖酰转移酶(ADP-ribosyltransferase)，具有破坏宿主细胞骨架促进化脓性链球菌在感染病灶部的繁殖能力[8]。sagA基因编码链球菌溶血素S(streptolysin S)是一种小分子的糖肽穿孔毒素，对淋巴细胞、中性粒细胞、血小板和上皮细胞均有破坏作用。链球菌溶血素S无抗原性。slo基因编码链球菌溶血素链球菌溶血素O(streptolysin O)为蛋白质穿孔毒素，已被证明会破坏细胞膜的完整性(包括多种细胞类型的上皮细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)[9]。链球菌溶血素O抗原性强。本文70株化脓性链球菌的spyA、sagA和slo等3种毒力基因检出率分别高达82.86%、97.14%和91.43%。由表4可见，每个分类单元的化脓性链球菌菌株均检出毒力基因,其中只有C分类单元(成员为4号菌株)、F分类单元(成员为9号菌株)，共2株菌仅携带1种毒力基因(2.86%)，其余均携带2种以上毒力基因(97.14%)。2016年，Ibrahim等[10]对分离自咽炎和皮肤感染者的9株化脓性链球菌进行了全基因组测序分析，该9株化脓性链球菌均携带sagA和slo基因。本研究提示spyA、sagA和slo 3种毒力基因是化脓性链球菌常见的毒力基因。推测它们是化脓性链球菌感染导致感染灶局部炎症和坏死的原因。本文样本聚类分析可见，70株化脓性链球菌分为A～N共14个分类单元，根据是否携带ermB基因，可分为Ⅰ和Ⅱ2个群，Ⅰ群9个分类单元(65株)均携带ermB基因，Ⅱ群5个分类单元(5株)均不携带ermB基因。并且Ⅰ群中intTN916、sagA和slo的携带率亦较高，推测化脓性链球菌对大环内酯类药物高耐药率是耐药基因和毒力基因共同作用的结果。

表4 70株化脓性链球菌耐药与毒力基因检测结果样本聚类分析(分类单元与阳性模式及占比)Tab.4 Sample cluster analysis of resistant determiants and virulence factors in 70 S.pyogenes (OTUs, positive modes and positive rates)