注射剂中磷酸川芎嗪有关物质的分析

郑建勇 田慧 王正斌 龚静

杏芎氯化钠注射液由两种主要成分银杏叶提取物和磷酸川芎嗪组成, 临床用于治疗缺血性心脑血管疾病, 如脑供血不足、脑血栓的形成、脑栓塞、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心脑血管疾病, 其中主要原料为磷酸川芎嗪(tetramethylpyrazine hosphate, TMPP), 化学名称为 2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪磷酸盐一水合物, 为一种新型的钙离子拮抗剂［1,2］, 有活血化瘀、抗血小板凝集、扩张小动脉、疏通微循环、促进炎症吸收等作用［3,4］, 临床上主要用于脑梗死、缺血性脑血管病、冠心病、心绞痛、糖尿病并发症等治疗。本文通过对原料及制剂中磷酸川芎嗪中有关物质的对比研究分析, 确定制剂中有关物质的来源、结构并进行定量检测, 报告如下。

1 材料来源

1.1 试验方法 Agilent 1260 Ⅱ高效液相色谱仪；Agilent 6470 三重四极杆质谱；杂质1 对照品(Aldrich, CBR00478)；甲醇、醋酸均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备 取磷酸川芎嗪原料(CX1705801), 加水溶解并稀释制成0.5 mg/ml 的溶液, 作为供试品溶液；精密量取1 ml, 置200 ml量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 作为对照溶液。

2.2 色谱条件 照高效液相色谱法试验, 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(45∶55)为流动相；检测波长为295 nm。分别称取磷酸川芎嗪对照品2 mg 与邻苯二甲酸二甲酯对照品12 mg, 置同一100 ml 量瓶中, 加甲醇2 ml 溶解, 用水稀释至刻度, 摇匀, 作为系统适用性溶液, 取20 μ1 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 理论板数按川芎嗪峰计算, ≥2000, 川芎嗪峰与杂质Ⅰ峰的分离度应＞4.0。精密量取供试品溶液与对照溶液各20 μl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图至主成分峰保留时间的3 倍。

2.3 试验结果 供试品溶液的色谱图中有三个有关物质峰, 见图1。峰面积之和不大于对照溶液主峰面积的0.5%。

图1 磷酸川芎嗪中有关物质结构

2.4 物质结构探索 采用UHPLC-QTOF 质谱和UHPLCQQQ质谱, 对图1中三个有关物质峰(杂质峰)进行定性研究, 经结构推断, 并结合文献, 杂质1 为(3, 5, 6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇［化学物质登记号(CAS No.)：75907-74-3］, 杂质2 为2, 3, 5-三甲基吡嗪(CAS No.：14667-55-1), 杂质3 为2-乙基-3, 5, 6-三甲基吡嗪(CAS No.：17398-16-2)。其中杂质1、杂质2 经对照品确认, 杂质3 为根据其精确分子量、二级质谱及文献报道推测。见图2。根据ICH 规定, 原料中主成分每日最大摄入量≤2 g 时, 杂质报告限为0.050%。采用主成分自身对照法, 经检验, 本品原料中杂质1 相对含量为0.030%, 杂质2 为0.030%, 杂质3 为0.010%, 均小于ICH规定的报告限。

图2 供试品溶液的色谱图

3 杏芎氯化钠制剂中磷酸川芎嗪有关物质初探

参照原料方法, 以高效液相色谱法测定制剂中杂质含量, 结果银杏叶提取物对其测定干扰较大, 无法有效分离, 因此采用专属性更强的液质联用方法。

采用液质联用法进行测定, 因质谱测定基质效应影响较大, 原料用空白基质(不含磷酸川芎嗪)溶液配制成0.4 mg/ml 的溶液, 再用水稀释为50 μg/ml 的溶液；注射液(磷酸川芎嗪处方量0.4 mg/ml 均采用该批号原料投料)用水稀释为含磷酸川芎嗪50 μg/ml 的溶液, 比较二者峰面积。

结果表明, 杂质1、杂质2、杂质3 峰面积基本一致。可见该原料有关物质在制剂生产过程未发生变化, 为了进一步确定杂质含量, 拟通过杂质1 含量进行准确定量的表征。

3.1 溶液的配制 对照品溶液的制备：取杂质1 对照品(Aldrich, CBR00478)适量, 精密称定, 加空白基质(不含磷酸川芎嗪)溶液制成含量为50、10、5、2、1 ng/ml 的系列溶液, 作为对照品溶液。供试品溶液的制备：直接进样测定。

3.2 色谱条件 色谱质谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(45：55)为流动相, 采用三重四极杆质谱检测器, ESI 负离子模式下MRM, 监测离子对：153.1 →135.0, 153.1 →53.2。

测定法：分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各0.1 µl, 注入液相色谱-质谱仪, 测定。

3.3 试验结果 杏芎氯化钠制剂中杂质1 含量为0.007%, 远低于ICH 对制剂中杂质报告限规定的0.100%, 安全风险 较低。