医院制剂补血通络丸的HPLC 指纹图谱研究

陈莹 梁栋 王小川 李国宏 梁颖 何捷

补血通络丸是由本院医生协定处方研制而成, 由黄芪、三七、当归、地龙、甘草配伍组成, 具有补益气血、活血通络的功效, 主要用于股骨头坏死及各类骨伤疼痛。现执行的制剂质量标准仅对黄芪进行薄层鉴别, 处方其他药物无控制手段, 不能全面反映该制剂质量状况。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段, 其是建立在中药化学成分系统研究的基础上, 可用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性［1］。因此, 本文在参考文献［2-7］的基础上, 以补血通络丸为研究对象, 利用指纹图谱的研究思路, 考察多种成分的变化情况, 对该制剂进行指纹图谱研究, 用于产品批次间质量稳定性评价, 同时为后续全面提高该制剂质量水平提供依据和参考, 报告如下。

1 材料来源

1.1 药品与试剂 甘草苷(批号：111610-201005, 中国药品生物制品检定所)；10 批次补血通络丸均由内江市中医医院提供。见表1。乙腈(Flesher)色谱纯；甲醇(成都市科隆化学品有限公司)分析纯、磷酸(西陇化工股份有限公司)分析纯；水为超纯水。

表1 补血通络丸样品批号表

1.2 仪器 高效液相色谱仪(Agilent1260)；电子分析天平(梅特勒-托力多AG285)；超纯水机(上海摩勒科Molelement-1890V)；超声波清洗机(天津市瑞普电子仪器公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱(4.6 mm× 250.0 mm, 5 µm), 以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相, 即以乙腈为流动相A、以0.1%磷酸溶液为流动相B, 按流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱。流动相梯度洗脱程序见表2。检测波长为220 nm, 柱温 25℃, 流速为1.0 ml/min, 进样量为10 μl,检测时间为65 min。理论板数按甘草苷计算应≥5000。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 制备对照品溶液 取甘草苷对照品适量, 精密称定, 加入甲醇, 制成每1 ml 中含甘草苷50 μg 的溶液, 作为对照品溶液。

2.2.2 制备供试品溶液 取补血通络丸适量, 研细, 混匀, 取约1 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 加甲醇50 ml, 密塞, 超声处理(功率250 W, 频率40 kHz)30 min, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得供试品溶液。

2.3 方法学的考察

2.3.1 精密度试验 取同一批补血通络丸制成的供试品溶液(批号：170911), 连续进样6 次, 按“2.1”项下色谱条件进行测定, 结果各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD 值均＜2.0%。该方法和仪器的精密度均良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一批补血通络丸制成的供试品 溶液(批号：170911), 分别在0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、24.0 h 进样分析, 记录HPLC 图谱, 采用2012 年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行评价, 各色谱图的相似度＞0.95, 相对峰面积的RSD 值＜1.5%, 供试品溶液在放置24 h内稳定。

2.3.3 重复性试验 取同一批补血通络丸(批号：170911), 按“2.2.2”项下方法平行操作, 制备6 份供试品溶液, 分别进样分析, 记录HPLC 图谱, 采用2012 年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行评价, 相似度均＞0.95, 且RSD 值为0.38%, 该方法重复性好。

2.4 指纹图谱的建立及相似度评价

2.4.1 指纹图谱的建立 分别取10 批次补血通络丸, 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下方法进行测定并记录65 min 色谱图, 结果所有色谱峰均集中在60 min内。选择5～65 min 中色谱峰, 时间窗宽度为0.2 min, 进行全峰匹配。10 批次样品色谱图中, 有19 个共有峰, 且共有峰总面积占总峰面积＞85%, 由此建立标准图谱。见图1。经与对照品色谱图相比对, 可确认图中5 号峰为甘草苷、6 号峰为阿魏酸。由于5 号峰峰面积相对较大且保留时间适中, 且为补血通络丸中的主要活性成分, 因此选该峰为内参比峰。计算共有峰峰面积和保留时间相当于内参比峰峰面积和保留时间的比值。各样品共有峰的相对保留时间(平均值)依次为：0.406、0.539、0.913、0.963、1.000(S)、1.060、1.455、1.656、1.735、1.875、1.945、2.370、2.449、2.480、2.547、2.574、2.768、3.059、3.487；各样品共有峰的峰面积全部标定并计算(取平均值)依次为：0.373、0.497、0.407、1.353、1.000(S)、0.232、0.272、0.292、0.271、0.753、0.588、0.249、0.152、0.264、0.135、0.137、0.197、0.606、0.641。

图1 补血通络丸标准指纹图谱

2.4.2 相似度计算 将10 批次补血通络丸色谱图导入 2012 年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》, 与建立的标准图谱进行比较, 并对10 批次样品的指纹图谱进行相似度分析, 指纹图谱相似度计算结果分别为：0.979、0.980、0.973、0.981、0.961、0.962、0.974、0.973、0.979、0.954, 相似度均＞0.95。

3 讨论

本实验对供试品提取溶剂、流动相系统及检测波长进行了筛选研究。一般实验多用甲醇及50%甲醇提取, 甲醇及50%甲醇都能提取制剂中有效成分, 峰高也基本一致, 但甲醇提取的成分更多, 主要特征峰强, 分离度最佳［8-10］, 故本研究选用甲醇作为样品提取溶剂。选用乙腈-0.1%磷酸水作为流动相用于梯度洗脱, 所得19 个共有峰分离良好。用二极管阵列检测器(DAD), 在203、220、240、250、270、290、300 nm 同时对一针样品检测, 检测器在220 nm 处, 峰信号强且出峰多, 特征峰干扰少, 分离度好, 故本研究选用220nm作为指纹图谱的检测波长。

本研究建立的补血通络丸指纹图谱经过方法学考察, 19 个共有峰的相对峰面积和相对保留时间的精密度、稳定性及重复性均好, 10 批次指纹图谱的相似度均＞0.9, 能满足中药指纹图谱测定要求, 且说明补血通络丸的制备工艺稳定。

本实验建立的补血通络丸的指纹图谱可用于该制剂的质量控制, 评价批次间制剂的稳定性, 同时, 该方法比常用的薄层色谱法先进、科学, 更能全面反映产品质量。