鹅食欲素及其受体2基因克隆、序列和组织表达分析

欧阳清渊，梁金敏，王郁石，甘 翔，胡深强，王继文

(四川农业大学 动物科技学院，四川 成都 611130)

食欲素(Orexin，OX)系统在调节睡眠、觉醒、饮食行为、自主神经等生理活动上具有重要作用[1]。OX由食欲素前原(HCRT)基因编码翻译、水解得到，HCRT基因翻译的前体食欲素蛋白(Prepro-orexin)产物水解后产生食欲素A(OXA)和食欲素B(OXB)2种多肽[2-3]。OX生物学功能的发挥主要依赖于食欲素受体1(HCRTR1)和食欲素受体2(HCRTR2)的介导作用，值得注意的是，HCRTR2是OXA和OXB的非选择性受体。Yi等[4]研究显示，食欲素能够增加摄食，是机体能量平衡调节网络中的重要物质。活体和体外研究证实，食欲素对胰岛素分泌具有急性刺激作用[5]。也有研究表明，脑室注射OXA 使胃酸、胰液分泌量持续显著增加[6]。Tamura等[7]研究发现，对于切除卵巢的大鼠，食欲素可抑制黄体生成素(LH) 的波动性分泌。Hoskins等[8]研究表明，食欲素和促性腺激素在金鱼的繁殖过程中有系统协调控制现象。以上研究结果提示，作为下丘脑分泌的一种重要神经肽，食欲素除在调节机体食欲和能量代谢平衡中起整合作用外，还可参与调节生殖内分泌、胃肠活动等多种生理过程[9]。

前人研究表明，食欲素不仅存在于下丘脑而且广泛分布于外周组织如肾上腺、肾脏等[10]。与此同时，食欲素受体主要在脑组织中表达，在部分外周组织如肾上腺、胃肠道和胰腺中也有表达。在人和鼠等哺乳动物上都通过克隆得到HCRT和HCRTR2完整的编码区序列[11-12]。在禽类上仅有原鸡的HCRT和HCRTR2完整编码区序列被克隆[13-14]，未见鹅的HCRT和HCRTR2基因序列报道。作为重要的家养经济动物之一，鹅产蛋性能差制约着鹅产业的发展。鉴于四川农业大学水禽课题组前期在产蛋和就巢鹅转录组测序结果中发现了食欲素基因表达量存在显著差异，笔者推测其可能与鹅的产蛋性能相关。因此，本研究旨在克隆鹅HCRT和HCRTR2基因完整编码区序列并进行生物信息学分析，同时检测HCRT和HCRTR2在四川白鹅各组织中的表达情况，以期为进一步探究食欲素及其受体基因在鹅繁殖活动中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品采集

采集3只处于产蛋期的四川白鹅母鹅大脑、嗅球、下丘脑、小脑、松果体、垂体、肾上腺、胰腺、食管、腺胃、肌胃、舌、小肠、输卵管(峡部、伞部和膨大部)、子宫、阴道和卵巢组织，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。

1.2 RNA提取和cDNA制备

各样本总RNA按照TRIzol(Invitrogen，USA)的操作说明书提取。用Bio-Rad核酸蛋白检测仪测定浓度，经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性后，使用反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA，放入-20 ℃保存备用。

1.3 基因克隆

根据NCBI上人(NM_001524)、原鸡(NM_204185)和蜂鸟(XM_008505688)HCRT基因序列以及人(NM_001526)、原鸡(NM_001024584)和绿头鸭(XM_005009180)HCRTR2基因序列，应用Primer Premier 5.0分别设计用于扩增获得鹅HCRT和HCRTR2基因完整CDS区序列的特异性引物(表1)，引物送至深圳华大基因科技有限公司合成。

表1 RT-PCR引物信息Tab.1 Primer information of RT-PCR

采用10 μL反应体系：上下游引物各0.4 μL，模板1 μL，Master Mix 5 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR扩增条件：预变性：94 ℃ 3 min；变性：94 ℃ 30 s，退火：退火温度见表1，30 s，延伸：72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸 5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认后，用胶回收试剂盒(TaKaRa)回收，回收产物连接pMD19-T(TaKaRa)载体，转化至DH5α感受态细胞中。PCR检测阳性克隆后，挑选阳性菌液送往成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.4 生物信息学分析

利用DNAman 软件对克隆得到的片段进行拼接得到目的基因序列。利用NCBI中ORFfinder程序查找目的基因的开放阅读框，并使用NCBI中BlastN和Conserved Domains工具对目的基因序列翻译的蛋白进行相似性和保守功能区分析。利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行蛋白质跨膜区域分析。利用Predict protein(https://www.predictprotein.org/)预测蛋白质结构。利用Mega 6软件构建系统进化树。

1.5 RT-qPCR与统计分析

根据已克隆得到的鹅HCRT和HCRTR2序列，应用Primer Premier 5.0设计定量引物(表2)，委托深圳华大基因科技有限公司合成。

表2 定量引物信息Tab.2 Quantitative primer information

通过绘制标准曲线和对扩增产物进行测序验证引物的特异性。以各组织的cDNA 为模板，使用GAPDH和β-actin为内参基因，采用SYBR Premix Ex Taq 为荧光染料，用Bio-Rad CFX 荧光定量PCR仪检测HCRT和HCRTR2在四川白鹅各组织中的相对表达量，各个样品重复3次。采用12.5 μL反应体系：上下游引物各1 μL，荧光标记MIX 6.25 μL，cDNA模板4.25 μL。反应条件为95 ℃预变性10 s；95 ℃变性15 s，退火温度(表2)30 s，40个循环。循环结束后通过熔解曲线检测PCR产物的特异性。运用2-ΔΔCt法计算相对表达量，最后利用SPSS 20.0软件中 One-Way ANOVA进行单因素方差分析，LSD 进行差异显著性检验，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 鹅HCRT基因生物信息学分析

克隆得到大小为456 bp的鹅HCRT基因，经比对确定其覆盖HCRT基因完整CDS区(图1-A)，共编码151个氨基酸。经NCBI上Blast工具比对发现，鹅HCRT基因核苷酸和氨基酸序列与原鸡、食鱼鳄、鼠、人、爪蟾、斑马鱼的同源性分别为86%，77%，57%，63%，57%，54%和78%，70%，76%，64%，63%，39%。鹅HCRT基因翻译产物(即食欲素前体肽)经信号肽序列脱落和激素原转化酶催化作用下裂解这2个步骤[1]，最终得到含34个氨基酸的鹅OXA和含28个氨基酸的鹅OXB。通过Predict protein软件对OXA和OXB的结构进行预测，发现OXA在Cys7-Cys13和Cys8-Cys15处存在2个二硫键，而OXB并未预测到二硫键的存在。利用SMART软件对OXA和OXB的蛋白结构域分析，发现OXA和OXB均存在1个包含其全部序列的Orexin super family结构域(图1-B)。经NCBI的Blast P进行鹅HCRT基因各部分序列的同源性分析(表3)。结果表明，除斑马鱼外，OXA、OXB在不同物种中均非常保守，说明OXA和OXB在HCRT基因中扮演着重要的角色；但各物种间HCRT信号肽保守性较低，暗示其信号肽序列可能对于各物种的功能特性具有重要的意义。根据各物种HCRT氨基酸构建系统进化树(图2)，发现鹅的亲缘关系与原鸡最近，与斑马鱼最远。

A.鹅HCRT基因编码区核苷酸序列和翻译的氨基酸序列；B.鹅HCRT基因氨基酸序列比对及其结构位置示意图。图中灰底区域为各物种OXA序列，黑底区域为各物种OXB序列，*为激素原转化酶识别位点，“-”为与鹅完全一致序列，为了获得最佳对齐而引入的间隙用“.”号表示。图4同。

A.Nucleotide sequence and translated amino acid sequence in the coding region of gooseHCRTgene;B.Amino acid sequence comparison of gooseHCRTgene and its structural location. The gray bottom area in the figure is the OXA sequence of each species，the black bottom area is the OXB sequence of each species，* is the recognition site of hormone proto-invertase，"-" is the sequence completely consistent with goose，and the gap introduced for optimal alignment is denoted by ".".The same as Fig.4.

图1 鹅HCRT基因编码区序列及其结构位置示意Fig.1 Sequence of HCRT gene coding region and its structural location in goose

图2 HCRT系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of HCRT

2.2 鹅HCRTR2基因生物信息学分析

将克隆得到的3段基因扩增片段结果进行拼接，得到鹅HCRTR2基因序列长1 666 bp(图3)，含1个单一的ORF，长度为1 506 bp，编码501个氨基酸。将获得的鹅HCRTR2基因编码区序列及其所翻译的氨基酸序列，经NCBI网站Blast工具比对，发现其与原鸡、食鱼鳄、鼠、人、爪蟾、斑马鱼的同源性分别为94%，86%，80%，77%，74%，67%和95%，93%，88%，83%，82%，71%。利用SMART软件对OX2R的蛋白结构域分析，发现OX2R氨基酸序列第57-377位为7tmA_OXR结构域，第389-436位为Orexin_rec2 super family结构域(图4)，表明OX2R、OXA和OXB的结合位点很可能位于结构域Orexin receptor 2。TMHMM 2.0软件分析OX2R蛋白跨膜结构，发现OX2R为7次跨膜蛋白。经NCBI的BlastP进行鹅HCRTR2各部分序列的同源性分析(表4)。结果表明，鹅HCRTR2的氨基酸序列与不同物种的同源性很高，表明其在生物体中具有很重要的作用。根据各物种HCRTR2基因翻译的氨基酸序列构建系统进化树(图5)，仍然是鹅与鸡亲缘关系最近，爬行动物和哺乳动物次之，鱼类最远，与HCRT进化相一致。

图3 鹅HCRTR2基因编码区核苷酸及氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and amino acid sequences in the coding region of goose HCRTR2 gene

灰底为7tmA_OXR结构域，黑底为Orexin_rec2 super family结构域。Gray background is 7tmA_OXR domain，black background is Orexin_rec2 super family domain.

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图5 HCRTR2基因系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of HCRTR2 gene

A.HCRT mRNA在四川白鹅各组织中的相对表达量；B.HCRTR2 mRNA在四川白鹅各组织中的相对表达量。同组数据上所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。A.Relative expression of HCRT mRNA in tissues of Sichuan White Goose;B.Relative expression of HCRTR2 mRNA in various tissues of Sichuan White Goose.Different letters in the same group mean significant difference (P<0.05)，while the same letters mean insignificant difference (P>0.05).

2.3 鹅HCRT和HCRTR2 mRNA组织表达分析

RT-qPCR结果(图6)显示，HCRTmRNA在四川白鹅19个组织中均有表达(图6-A)，且在下丘脑和胰腺中的表达量显著(P<0.05)高于除松果体和子宫外的剩余组织，包括大脑、嗅球、小脑、垂体、肾上腺、食管、腺胃、肌胃、舌、小肠、输卵管峡部、输卵管伞部、输卵管膨大部、阴道和卵巢。鹅HCRTR2mRNA在下丘脑中的表达显著高于(P<0.05)其他组织，且在垂体和性腺组织(卵巢、子宫、阴道、输卵管峡部、输卵管伞部、输卵管膨大部)中均有表达(图6-B)。因此，推测食欲素系统可能主要通过下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)参与鹅生殖生理活动的调节。

3 结论与讨论

本试验成功克隆得到鹅HCRT和HCRTR2基因全长CDS区序列，长度分别为456，1 506 bp，各自编码151，501个氨基酸。TMHMM 2.0分析发现，HCRTR2基因编码的蛋白为7次跨膜蛋白，且极有可能位于胞膜，这与前人文献报道结果相一致[15]，即禽类中的HCRTR2与哺乳动物一样，也是位于胞膜的G蛋白偶联受体。

OXA与OXB是食欲素重要的功能执行单位[15]。通过分析发现，鹅OXA具有2个二硫键而OXB序列不具有二硫键，说明OXB有较小的替代作用；通过对比发现OXA和OXB在物种间具有高度的保守性，这也辅证了OXA、OXB所承担的重要生物学功能。HCRTR2基因在各物种间高度保守，但其所含结构域序列在禽类与哺乳类动物之间却存在着较大的差异。此种差异可能与禽类和哺乳动物之间的进食习惯与节律差异有关，推测其可能与对应的HCRTR2的功能特性有密切的联系，是体现HCRTR2种属间功能差异的关键区段。这也从侧面说明了鹅，乃至禽类的HCRTR2可能对其食欲素作用有相对独特的意义。

RT-qPCR结果显示，鹅HCRTmRNA除了在下丘脑表达外在其他外周组织中也均有表达，这与在鼠和人中的研究一致[10,16]。鹅HCRTmRNA在下丘脑和胰腺中的表达量显著(P<0.05)高于大脑和嗅球等15个组织，但不显著高于松果体和子宫。鹅HCRTR2mRNA在下丘脑中的表达显著(P<0.05)高于其他组织，在胰腺和肾上腺2个内分泌组织中的表达量仅次于下丘脑，在脑部组织、繁殖器官及消化器官中均有不同程度的表达。HCRT及HCRTR2mRNA均在下丘脑表达最高，且均在垂体及性腺组织(卵巢、子宫、阴道、输卵管峡部、输卵管伞部、输卵管膨大部)中有表达，提示食欲素系统可能通过下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)参与动物生殖机能的调节[17]。同时，食欲素系统可能还参与了应激对繁殖功能的调控，HCRT能促进肾上腺皮质分泌糖皮质激素[18]，这与本研究在HCRT和HCRTR2mRNA中检测到肾上腺的表达相一致。此外，光照长短能调节松果体中褪黑激素的分泌，而褪黑激素正是可以通过G 蛋白偶联受体途径来实现对繁殖功能的调控[19]。本研究中HCRT和HCRTR2mRNA在松果体中均有表达这一结果，提示食欲素系统可能与鹅的季节性繁殖有关。

综上，本试验克隆得到了鹅HCRT和HCRTR2基因完整CDS区序列，分别为456，1 506 bp，各自编码151，501个氨基酸。RT-qPCR结果显示，HCRT和HCRTR2基因在鹅下丘脑中表达量达到最高，在其他组织中也有不同程度的表达，提示食欲素系统可能通过下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)参与动物生殖机能的调节。以上研究结果有助于进一步阐明HCRT和HCRTR2基因在鹅繁殖活动中的作用及其分子机制。