基于修饰蛋白酶的羊毛织物防毡缩整理

梅静霞， 张 楠， 王 强， 袁久刚， 范雪荣

(生态纺织教育部重点实验室(江南大学)， 江苏 无锡 214122)

羊毛织物由于表面鳞片层的存在导致其在洗涤过程中会发生严重的毡缩现象，大大降低了羊毛的使用价值[1]。传统的防毡缩加工主要采用氯化处理来破坏鳞片或者通过聚合物沉积覆盖鳞片[2]。氯化处理过程中产生的可吸收有机卤化物(AOX)对人体健康和生态环境造成严重危害，而聚合物覆盖法会恶化羊毛本身优良的手感，导致织物舒适性下降[3-4]。

近年来，蛋白酶以其高效、作用专一、使用条件温和以及环境友好的优势在羊毛防毡缩整理中的应用越来越受关注[5]。由于羊毛鳞片含有大量二硫键交联的角蛋白质，因此，蛋白酶会优先水解非角质化可溶胀的细胞膜复合物(CMC)，进而通过细胞间间隙进入纤维内部，破坏纤维内部主体结构，导致纤维强力急剧下降[6]。相关研究[7-9]表明，通过化学修饰使蛋白酶分子体积增大，可以控制蛋白酶只作用于羊毛鳞片层而不通过CMC进入皮质层，以此来降低纤维主体损伤。但需指出的是，由于蛋白酶具有专一性，只能水解肽键，对富含角蛋白质的鳞片层的水解作用有限，因此，不得不采用各种预处理[5]如过氧化氢、高锰酸钾、亚硫酸钠等氧化剂/还原剂预先破坏角蛋白质中的二硫键，以此来增强修饰酶的作用效果。

本文研究从水解羊毛鳞片中富含二硫键交联的角蛋白质出发，采用碳二亚胺/琥珀酰亚胺(EDC/NHS)使聚乙二醇二羧酸(HOOC-PEG-COOH)和L-半胱氨酸对蛋白酶进行修饰，开发了一种新型的改性蛋白酶，以期来强化修饰酶对鳞片层中角蛋白的水解作用。

1 实验部分

1.1 实验材料与试剂

蛋白酶(Savinase 16 L)，诺维信生物技术有限公司；聚乙二醇二羧酸(HOOC-PEG-COOH)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，98%)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，98%)和吗啉乙磺酸(MES，99%)，阿拉丁生化试剂股份有限公司；其他化学试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

羊毛织物(华达呢，200 g/m2)和羊毛纤维(35 μm)，无锡协新毛纺织有限公司。

1.2 主要实验仪器

HD026NS型电子织物强力机(南通宏大实验仪器有限公司)，CM195型冰冻切片机(德国莱卡公司)，Y(B)089D型全自动缩水率试验机(温州大荣纺织标准仪器厂)，JC2000D4型接触角测试仪(上海中晨数字技术设备有限公司)，SU1510型扫描电子显微镜(日本日立公司)，DMM-300C型光学显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.3 蛋白酶的化学修饰

配制50 mmol/L pH值为5.5的MES缓冲溶液和EDC/NHS(量比为1∶1)溶液备用。首先，向MES溶液中加入1 mL HOOC-PEG-COOH和EDC/NHS溶液(羧基的2倍当量)，37 ℃磁力搅拌30 min活化羧基；再加入L-半胱氨酸(HOOC-PEG-COOH的3倍当量)，37 ℃避光反应5 h后加入蛋白酶(蛋白酶与PEG量比为1∶200)，4 ℃避光反应16 h。反应结束，透析24 h再超滤直至除尽未反应的PEG和半胱氨酸，最后冷冻干燥得到修饰酶(SAV-PEG-L-cys)。前期研究[10]表明：蛋白酶成功与HOOC-PEG-COOH和L-半胱氨酸进行共价连接，所得修饰酶体积是原酶的3.25倍，且具有还原二硫键的能力。

1.4 羊毛防毡缩整理

羊毛织物或纤维在pH值为8.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液中，浴比为1∶25，温度为40 ℃条件下加入 5 U/mL 蛋白酶Savinase、修饰后蛋白酶(SAV-PEG-L-cys)和与SAV-PEG-L-cys中等量的 L-半胱氨酸与蛋白酶混合物分别处理1～4 h。之后于85 ℃灭活10 min，水洗，晾干。

1.5 蛋白酶整理羊毛织物性能测定

1.5.1 毡缩率

取尺寸为15 cm×15 cm的织物，参照ISO 6330: 2012《纺织品家庭洗涤和干燥程序 纺织品测试》测试羊毛织物毡缩率，结果取3组平行试样的平均值。

1.5.2 断裂强力

织物尺寸为25 cm×5 cm，参照 GB/T 3923—1997《织物断裂强力和断裂伸长率的测定》进行织物强力测试，结果取3组平行试样的平均值。

1.5.3 羊毛表面形貌观察

羊毛纤维镀金后，采用扫描电子显微镜观察其表面形貌，电压为5.00 kV，放大倍数为1 500。

1.5.4 接触角

采用接触角测试仪，向测试织物上滴1滴去离子水，测试100 s时接触角数值。

1.5.5 阿尔瓦登反应

取一小束不同酶处理的羊毛纤维于载玻片上，滴2滴饱和溴水，在显微镜下观察并拍摄3 min后羊毛纤维的阿尔瓦登(Allworden)反应，放大倍数为400。

1.5.6 羊毛酶解程度

采用着色法评定羊毛酶解程度。取一束不同酶处理的羊毛纤维，用冷冻包埋剂包埋放在 -20 ℃过夜，用冰冻切片机切成10 μm的薄片放于载玻片，之后用注射针滴加3滴质量分数为0.005%的亚甲基蓝溶液到羊毛纤维上，在显微镜下观察并拍摄 3 min 后染料渗入纤维的情况[11]。

2 结果与分析

2.1 修饰酶处理对羊毛防毡缩效果的影响

本文考察了修饰蛋白酶SAV-PEG-L-cys处理对羊毛织物毡缩率和强力损失的影响，并与Savinase、SAV-PEG-L-cys 和等量的L-半胱氨酸/Savinase混合处理后织物性能进行比较，结果如图1所示。

图1 处理时间对不同酶处理的羊毛织物毡缩率和强力损失的影响

Fig.1 Dimensional stability to felting(a) and strength loss(b) of wool fabrics treated with different proteases after different treatment time

图2 不同酶处理后羊毛织物的接触角(100 s)

Fig.2 Contact angles of wool fabrics at 100 s after different enzymatic treatments. (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

从图1(a)可以看出，随着酶处理时间的延长，织物毡缩率均呈下降趋势。对于缓冲溶液处理样，随着处理时间的延长，毡缩率逐渐下降，这是由于羊毛鳞片在碱性环境下会被溶解。而用蛋白酶Savinase处理羊毛织物时，半胱氨酸的加入使得织物毡缩率下降更明显。这是因为半胱氨酸能还原羊毛鳞片中角蛋白二硫键，使蛋白酶能更好地与羊毛接触并强化其肽键水解作用。但是在等量的半胱氨酸和蛋白酶的条件下，SAV-PEG-L-cys处理样在1、2 h 处理效果均不及L-半胱氨酸/Savinase处理样，这是因为后者中半胱氨酸和蛋白酶是游离的，作用范围更广。而处理3、4 h后，SAV-PEG-L-cys处理效果较好。其中，SAV-PEG-L-cys处理4 h织物的毡缩率与处理 3 h 相近，这说明PEG分子的引入增大了蛋白酶的体积，空间位阻变大。因此，再延长处理时间对毡缩率的影响不大[7]。此外，经SAV-PEG-L-cys处理3 h的羊毛织物毡缩率(6.12%)最低，并且达到了可机洗标准。

由图1(b)得知，随着酶处理时间的延长，织物强力损失率呈上升趋势。对比蛋白酶Savinase处理样和L-半胱氨酸/蛋白酶Savinase混合处理样，半胱氨酸的加入使得羊毛强力损失更严重，这是因为半胱氨酸能还原羊毛鳞片中的二硫键，加速了蛋白酶对羊毛的水解作用。但是在等量的半胱氨酸和蛋白酶的条件，SAV-PEG-L-cys处理样的强力损失率比L-半胱氨酸/Savinase处理样小得多，这是因为蛋白酶经修饰后，体积变大，在空间位阻作用下不能进入纤维内部，因此修饰酶对羊毛的水解只能作用在纤维表面，损伤较小[12]。

综合考虑毡缩率和强力损失率2个影响因素，修饰酶处理时间以3 h最优，即该条件下处理后羊毛织物的毡缩率为6.12%，强力损失率为11.7%。

2.2 修饰酶处理对羊毛润湿性能的影响

羊毛是一种集较强的疏水性和良好的吸湿性于一身的蛋白质纤维，其疏水性是由纤维表面性质(含疏水的类脂结构)决定的，而吸湿性主要与其内部亲水性分子结构有关[13]。测定羊毛织物润湿性可了解纤维表面类脂层及鳞片结构的破坏程度。图2 示出不同酶处理后羊毛织物的接触角。

由图2可以看出，羊毛原样接触角为118.3°，表明羊毛表面的疏水性较强，主要是因为羊毛鳞片表层的类脂层结构具有较强的疏水性，且纤维间存在的静止空气也会一定程度地阻碍水滴的铺展与渗透。空白样的接触角有所下降，是因为碱性缓冲溶液对类脂结构有一定的溶解作用。而Savinase处理样与空白样接触角相近，这是由于蛋白酶对类脂层没有破坏作用，而类脂层的存在也会阻碍蛋白酶对羊毛鳞片的作用。加入半胱氨酸后，接触角下降明显，降至95.9°，这是因为半胱氨酸能将鳞片层中的二硫键 —S—S— 断裂，剥去一部分类脂层，并且能使二硫键 —S—S— 还原成亲水性的—SH。而对于SAV-PEG-L-cys处理样的接触角为107.5°，处理效果不及等量的半胱氨酸与蛋白酶联合处理，这是因为前者体积较大，较难与鳞片层的接触，而且修饰酶中半胱氨酸与蛋白酶是共价连接的，对鳞片层中的二硫键和酰胺键破坏范围不及后者[10]。

2.3 修饰酶处理羊毛的Allworden反应

Allworden反应是考察羊毛鳞片结构完整性的有效方法。羊毛纤维经溴水处理后，其鳞片层的二硫键在溴水的氧化作用下会发生断裂，形成亲水性很强的磺酸基团和少量的水溶性蛋白，从而出现鳞片层内外渗透压之差，水分向里渗透，形成泡状物[14]；因此，在相同时间内，可以根据纤维表面泡状物的多少与气泡大小来评判羊毛鳞片层破坏程度。图3示出不同酶处理后羊毛纤维的Allworden效应。

图3 不同酶处理后羊毛纤维的Allworden效应(×400)

Fig.3 Allworden reactions of wool fibers after different enzymatic treatments (×400). (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

从图3可以看出：原毛表面整齐地排列着一层密而大的气泡，出现明显的Allworden反应；缓冲溶液处理样相比原毛表面的气泡稍微变少，说明碱对纤维鳞片有轻微破损；与之相比，用蛋白酶Savinase处理的羊毛表面的气泡也稍微减少，这是因为蛋白酶能水解酰胺键，羊毛鳞片有一定损伤；而在加入半胱氨酸后，L-半胱氨酸/Savinase处理样表面几乎没有气泡，说明在半胱氨酸和蛋白酶的联合作用下，鳞片中的二硫键和酰胺键被完全破坏，羊毛表面受损严重[14]；经修饰酶SAV-PEG-L-cys处理的羊毛表面有较少气泡，与L-半胱氨酸/Savinase处理样相比，在半胱氨酸与蛋白酶含量相同的情况下，由于修饰酶是通过共价连接的，作用范围不及分开混合作用，但是与原酶相比，修饰酶对鳞片的损伤更大。

2.4 修饰酶处理对羊毛表面形态的影响

本文分别采用Savinase、SAV-PEG-L-cys和等量的L-半胱氨酸/Savinase混合处理羊毛织物，用扫描电子显微镜来观察羊毛纤维表面形态的变化，并与未处理羊毛进行对比，结果如图4所示。

从图4可看出：未处理羊毛鳞片完整，边缘轮廓非常清晰。只有缓冲溶液处理的纤维的鳞片略有损伤，这是因为碱性缓冲液对羊毛有一定的溶解作用；对于蛋白酶Savinase处理的羊毛纤维，鳞片边缘轮廓不太清晰，纤维鳞片有一定损伤，经过半胱氨酸和Savinase蛋白酶联合处理样，鳞片破坏严重，说明半胱氨酸的加入加强了蛋白酶对鳞片的水解作用。再对比图4中(d)和(e)，在半胱氨酸与蛋白酶用量相同的条件下，修饰酶SAV-PEG-L-cys对纤维鳞片损伤较轻，表面较为光滑，与前面所得到的毡缩率和强力损失率结果一致，这是因为修饰酶体积增大，不能进入纤维内部而只作用羊毛鳞片。

图4 不同酶处理3 h后的羊毛纤维的SEM照片(×1 500)

Fig.4 SEM images of wool fabrics after different enzymatic treatments for 3 h(×1 500). (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

2.5 羊毛纤维酶解深度分析

羊毛纤维中半胱氨酸剩基中羧基和巯基以及蛋白酶水解肽链时产生的羧基在pH值大于7.0时均带负电荷，因此，还原剂和蛋白酶在羊毛中的作用程度可以通过碱性阳离子染料亚甲基蓝染料着色强度与分布加以评定[11]，结果见图5。

图5 不同酶处理酶对羊毛的破坏程度照片(×400)

Fig.5 Photographs of wool fibers after different enzymatic treatments (×400). (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

原毛和缓冲溶液处理样都没有染料渗入，而经过Savinase蛋白酶处理后的羊毛内部有染料渗入。这是因为蛋白酶能通过CMC进入羊毛内部皮质层并产生水解作用，释放游离羧基负离子，与阳离子染料(亚甲基蓝)结合，由此说明蛋白酶对羊毛纤维内部有一定的水解破坏。而对于L-cysteine/Savinase处理样，染料几乎覆盖整个纤维内部，说明半胱氨酸的加入增强了蛋白酶对羊毛的水解作用，羊毛损伤严重，与上述结论相同。相比图5(d)和(e)，在等量的半胱氨酸与蛋白酶以及染色时间相同的条件下，经修饰酶SAV-PEG-L-cys处理的羊毛纤维，渗入的染料要少得多，且主要集中在羊毛外部鳞片层而没有进入皮质层。这说明修饰酶基本不破坏羊毛纤维的主体结构，只作用在鳞片层。这种表面定域催化作用是由于PEG分子的引入增大了蛋白酶的分子体积使其不能通过纤维内部皮质层，而只能作用表面鳞片层。

3 结 论

1) 通过探究修饰酶处理对羊毛防毡缩效果的影响，确定修饰酶整理最佳时间为3 h，其毡缩率为6.12%，达到机可洗标准，其强力损失为11.7%；而未修饰蛋白酶处理的织物的毡缩率均未达到“机可洗”标准且强力损失均高于修饰蛋白酶。

2) 通过接触角测试、Allworden反应、SEM观察以及着色法等实验结果，证明修饰蛋白酶只作用羊毛鳞片层，通过半胱氨酸还原二硫键，蛋白酶水解肽键，达到破坏鳞片而不损伤纤维主体结构的作用。

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