体外法研究五株酵母菌对牛瘤胃代谢的复合效应

赵亚军，裴彩霞，刘强，钞瑞敏，陈婧

(山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

近年来，活性酵母作为动物饲料添加剂应用广泛。据报道，反刍动物饲粮中添加活性酵母菌制剂对反刍动物瘤胃发酵、生产性能、产品质量以及机体免疫水平等方面产生积极的作用[1～4]，在反刍动物添加剂领域具有非常大的潜力和发展空间。目前，关于酵母菌的研究很多，但研究结果存在一定差异。Dawson等[5]试验发现奶牛日粮中添加酵母菌制剂可以增加瘤胃活菌的数量；Erasmus等[6]发现酵母添加剂使奶牛MCP合成有增加趋势；张棋炜等[7]研究发现，添加复合酵母发酵饲料能够增加发酵液的产气量，提高NH3-N含量，促进乙酸、丁酸和TVFA的生成；李常瑞等[8]研究发现，复合酵母可以提高底物的干物质降解率和氨氮、VFA浓度，对瘤胃发酵具有一定的促进作用。这些差异可能是由于菌株的不同引起的，而不同酵母菌间的复合效应尚未见报道。

本试验拟研究高精料条件下，通过研究5株单一酵母及其不同组合对牛瘤胃发酵液参数的影响，以探讨不同酵母菌间的复合效应，为反刍动物生产中优质、高效复合酵母菌株的筛选及其营养生理调控研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的产朊假丝酵母(Candidautilis,I)、酿酒酵母A(SaccharomycescerevisiaeA,Ⅱ)、酿酒酵母B(SaccharomycescerevisiaeB,Ⅲ)、酿酒酵母C(SaccharomycescerevisiaeC,IV)和热带假丝酵母(Candidatropicalis,V)等5株酵母菌均由山西农业大学动物营养实验室提供。

1.2 试验动物及饲养管理

试验选取2头体况良好安装有永久性瘤胃瘘管(内径约8 cm)的晋南牛作为瘤胃液供体。试验动物单栏饲养，试验前分别进行免疫和驱虫处理。饲粮按精粗比65:35配制(精料组成为玉米66.8%，豆粕30%，石粉1.6%，食盐0.6%，预混料1%；粗料为青贮玉米秸秆)分别于每日08:00与20:00各饲喂一次，自由饮水。

1.3 试验方法

1.3.1 人工瘤胃缓冲液配制

人工瘤胃缓冲液在厌氧条件下配制，其各组分参照Menke等[9]的方法配制，组成见表1。单株酵母添加剂活菌数为1×108CFU·30 mL-1，2株酵母及3株酵母组合添加剂分别按体积(V/V)1∶1、1∶1∶1配制，使各组合的活菌数达到1×108CFU·30 mL-1。

1.3.2 瘤胃液的采集

晨饲前2 h通过瘤胃瘘管采集2头牛瘤胃液并按1∶1(V/V)的比例混合，混合好的培养液投入充满CO2的保温箱(39 ℃)，预热迅速带回实验室。

表1 人工瘤胃缓冲液各组分组成Table 1 Composition of artificial rumen buffer

1.3.3 体外培养

试验所用饲料与供体动物饲喂的饲料一致，饲料原料于65 ℃下烘干后粉碎并过2 mm目筛，每个发酵管及发酵瓶分装300 mg培养底物。试验设对照组(培养液)、单一酵母菌处理(单一酵母培养液)和复合酵母处理(复合酵母培养液)等多个处理，每个处理均设3个重复。将采集的瘤胃液测定pH值后经4层纱布过滤，将瘤胃液与人工瘤胃缓冲液以1∶2(V/V)混合，制成人工瘤胃培养液。吸取培养液30 mL，注入已装有样品的发酵管及发酵瓶中，添加活性酵母，使活菌数达到1×108CFU·30 mL-1培养液，整个过程避免与空气的直接接触，在39 ℃恒温振荡培养箱中培养，连续发酵48 h。

1.3.4 样品的采集和测定

分别于发酵培养后3、6、9、12、18、24、36、48 h通过读发酵管刻度记录产气量，并收集气体，同时采用pH计(EC-pH510标准智能型台式)测定发酵瓶收集的培养液pH值，并计算其平均值。发酵48 h后，测定pH值并分装。置于-40 ℃冷冻保存。其中，用于测定挥发性脂肪酸(VFA)的5 mL样品中加入1 mL的25%偏磷酸巴豆酸；用于测定氨态氮浓度(NH3-N)的5 mL样品中加入1 mL 20 g·L-1的硫酸。VFA、甲烷浓度采用TRACE-1300气相色谱仪(Thermo Fisher Scientific，美国)进行测定，微生物蛋白(MCP)[10]、NH3-N浓度[11]采用比色法测定，总产气量为各不同时间点产气量之和[9]。

所有体外发酵试验均设2次重复。

1.4 数据处理及统计分析

试验数据应用SPSS 17.0统计分析软件中的One-way-Anova进行方差分析，用P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 5株酵母菌及其组合对体外发酵pH、饲料降解率、NH3-N浓度、MCP、产气量和甲烷的影响

由表2可知，添加不同组合酵母菌对培养液pH值产生了不同影响。2株酵母组合中，I分别与Ⅱ、Ⅲ、IV、V组合后，Ⅲ分别与Ⅱ、IV、V组合后的pH值高于其中一株单菌，而与另一单菌无显著差异；Ⅱ分别与IV、V组合后极显著高于Ⅱ(P<0.01)，显著高于IV、V(P<0.05)。3株酵母Ⅱ+Ⅲ+IV组合pH值显著低于Ⅱ+Ⅲ(P<0.05)，Ⅱ+Ⅲ+V显著低于Ⅲ+IV、Ⅲ+V(P<0.05)，Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+IV+V极显著低于Ⅱ+IV(P<0.01)。

降解率方面，2株复合酵母较单菌变化较小，仅IV+V显著高于V(P<0.05)；3株复合菌中，Ⅱ+Ⅲ+IV显著高于IV、Ⅲ+IV(P<0.05)，Ⅱ+IV+V显著高于IV+V(P<0.05)。

NH3-N浓度方面，2株酵母组合中，I+IV、Ⅱ+IV、Ⅱ+V、Ⅲ+IV组合高于其中一株单菌，而与另一单菌无显著差异；Ⅲ+IV、IV+V组合均显著低于各单一菌株。3株菌中仅Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V组合NH3-N浓度显著低于V(P<0.05)。MCP浓度方面，I、Ⅱ、Ⅲ、IV分别与V组合显著高于V，而与另一单菌无显著差异(P>0.05)；Ⅱ+Ⅲ+IV极显著高于IV、Ⅱ+Ⅲ、Ⅲ+IV(P<0.01)；Ⅱ+IV+V极显著高于IV、V(P<0.01)，显著高于V、Ⅱ+V、IV+V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V显著高于V、Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+V(P<0.05)。

产气方面，Ⅱ与I、Ⅲ组合低于其中一株单菌，而与另一单菌无显著差异；Ⅱ分别与IV、V组合后极显著低于Ⅱ(P<0.01)，显著低于IV、V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V显著低于Ⅲ+V(P<0.05)。甲烷方面，I与Ⅱ、Ⅲ、IV、V组合后较各单菌均无显著差异(P>0.05)；Ⅱ与Ⅲ、IV、V组合后甲烷含量低于其中一株单菌，而与另一单菌无显著差异；3株菌Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V组合极显著低于Ⅱ(P<0.01)。

2.2 5株酵母菌及其组合对体外发酵VFA的影响

由表3可知，在高精料下，培养液中2株酵母组合在乙酸、丙酸和异丁酸的比例以及乙丙比方面较各单一菌株均无显著差异(P>0.05)，而3株酵母组合则产生了不同影响，其中，乙酸比例方面，Ⅱ+Ⅲ+IV显著低于IV、Ⅱ+Ⅲ，Ⅱ+Ⅲ+V显著低于Ⅱ、V、Ⅲ+V，Ⅱ+IV+V显著低于Ⅱ、IV、Ⅱ+V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V极显著低于Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+V，Ⅱ+IV+V极显著低于IV+V(P<0.01)。丙酸比例方面，Ⅱ+Ⅲ+IV显著高于Ⅱ、IV、Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+IV(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V显著高于Ⅱ+V、Ⅲ+V(P<0.05)；极显著高于Ⅱ、Ⅲ、V、Ⅱ+Ⅲ(P<0.01)。同样，Ⅱ+IV+V除显著高于Ⅱ+V外，均极显著高于组内各单一及2株组合菌(P<0.01)。乙丙比方面，Ⅱ+Ⅲ+IV显著低于Ⅱ、Ⅱ+IV(P<0.05)，极显著低于IV、Ⅱ+Ⅲ(P<0.01)；Ⅱ+IV+V除显著低于Ⅱ+V外，均极显著低于组内其他各单一及2株组合菌(P<0.01)；而Ⅱ+Ⅲ+V均极显著低于组内各单一及2株组合菌(P<0.01)。丁酸比例方面，Ⅱ+V、Ⅲ+V显著低于Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)，而与V无显著差异。戊酸比例方面，I+IV、Ⅱ+IV、V+I、Ⅲ+IV、V+Ⅱ组合低于其中一株单菌，而与另一单菌无显著差异。Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V组合均极显著高于组内各单一及2株组合菌(P<0.01)。异戊酸比例方面，I+IV、I+V、Ⅲ+V组合低于其中一株单菌，而与另一单菌无显著差异。Ⅲ+IV组合均极显著低于Ⅲ、IV(P<0.01)。TVFA方面，I+IV、I+V、Ⅱ+IV、低于其中一株单菌，而与另一单菌无显著差异。Ⅲ+IV、Ⅲ+V组合TVFA含量均显著低于Ⅲ，分别显著低于IV(P<0.05)，极显著低于V(P<0.01)；3株菌Ⅱ+IV+V组合显著低于IV、V(P<0.05)。

表2 酵母菌及其组合对体外发酵pH、饲料降解率、NH3-N浓度、MCP、产气量和甲烷的影响Table 2 Effects of yeasts and their combinations on pH,degradation rate,NH3-N,MCP,gas production and methane production in vitro

注：2株酵母(α+β)：分别与“α、β”相比差异极显著(P<0.01)标记为“A、B”，差异显著标记为“a、b”(P<0.05)。3株酵母(ɑ+β+θ)：分别与“α、β、θ、α+β、α+θ、β+θ”相比差异极显著(P<0.01)标记为“A、B、C、D、E、F”，差异显著标记为“a、b、c、d、e、f”(P<0.05)。下表同。
Note:Two kinds of yeast (α+β):marked “A,B” with significantly different from “α,β”(P<0.01),and marked “a,b” with significant difference (P<0.05).Three kinds of yeast (ɑ+β+θ):marked “A,B,C,D,E,F” with extremely significantly different from “α,β,θ,α+β,α+θ,β+θ”(P<0.01),and marked “a,b,c,d,e,f” with significant difference (P<0.05).The same as below.

3 讨论

瘤胃pH是评价瘤胃发酵环境的一项重要指标。高精料饲粮模式下，反刍动物咀嚼行为减少，唾液分泌量降低使唾液对瘤胃的冲作用下降[12]，伴随着VFA在瘤胃的沉积，导致瘤胃pH降低[13]。大量研究表明，酵母菌对稳定瘤胃pH具有积极作用，能够预防瘤胃酸中毒[14～16]。其作用机制可能是酵母菌促进了乳酸利用菌的增长从而缓解瘤胃pH的降低[17]，或酵母菌与作用在植物细胞壁上的微生物相互作用促进了纤维的降解[18]。本试验中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V组合pH值均显著高于各单一菌株，说明Ⅱ+IV、Ⅱ+V在促进瘤胃乳酸利用菌增长或促进纤维降解方面存在复合效应，能够进一步缓解瘤胃pH值的降低，对维持瘤胃内环境稳定具有重要作用。

表3 酵母菌及其组合对体外发酵VFA的影响Table 3 Effects of yeasts and their combinations on VFA fermentation in vitro

2株酵母组合对底物降解率较单菌差异较小，这可能由于体外培养时间过短无法准确评价酵母组合对底物纤维降解程度的影响[19]。Emmanuel等[20]、Gaafar等[21]试验表明，酵母菌能够刺激微生物生长，使瘤胃中的NH3大量转化为微生物蛋白质。本试验中，2株酵母Ⅲ+IV、IV+V组合NH3-N浓度显著低于各单一菌株，MCP含量显著高于其中一株单菌，说明Ⅲ+IV、IV+V菌株组合在促进瘤胃微生物生长方面具有复合效应，能够使瘤胃中的NH3大量转化为微生物蛋白质，从而降低NH3-N浓度。

Lynch等[22]研究表明，在瘤胃微生物发酵苜蓿草的过程中添加活性酵母菌，能够使甲烷产量降低20 %。Chaucheyras等[23]、Mwenya等[24]同样发现，日粮中添加酵母可降低甲烷产量，并认为其作用机制可能与氢利用的转移有关。本试验中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V组合产气量均显著低于各单一菌株，甲烷产量显著低于Ⅱ，与IV、V相比也有低的趋势，说明菌株组合在减少甲烷产生方面存在复合效应。

瘤胃VFA的产量和组成是评价瘤胃发酵方式和发酵能力的直接指标。Erasmus等[25]在奶牛日粮中添加酵母制剂可以增加丙酸含量、降低乙丙比。同样，邓露芳[26]、Mutsvangwa等[27]研究发现，添加益生菌可促进丙酸比提高，乙酸比降低，乙丙比降低。本试验中，2株组合酵母在乙酸、丙酸和异丁酸的比例以及乙丙比方面较单一菌株无显著差异。3株酵母组合Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V较组内各单一及2株组合菌存在极显著降低乙酸比例、增加丙酸比例、降低乙丙比的现象，说明3株酵母组合Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V在调节瘤胃发酵模式方面存在复合效应。Thrune等[28]、周传社等[29]研究发现，日粮中添加酵母培养物可使TVFA含量下降。本试验中，Ⅲ+IV、Ⅲ+V组合TVFA含量显著低于各单一菌株，存在复合效应。此外，本试验中，3株酵母Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V组合戊酸比例极显著高于组内各单一及2株酵母菌组合，其来源一方面由碳水化合物合成；另一方面来自脯氨酸、精氨酸、赖氨酸和蛋氨酸的降解产物[30]，说明3株菌组合Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V在促进戊酸形成方面存在复合效应。

4 结论

本试验发现，高精料条件下不同酵母组合对瘤胃发酵影响不同，在维持瘤胃内环境稳态方面，Ⅱ与IV和V存在复合效应；Ⅲ和IV、IV和V在降低NH3-N浓度方面存在复合效应。在调节瘤胃发酵模式方面，Ⅱ、Ⅲ和V以及Ⅱ、IV和V之间存在复合效应，乙酸比例及乙丙比均显著低于组内各单一及2株组合菌，丙酸比例均显著高于组内各单一及2株组合菌；Ⅱ、Ⅲ和IV在戊酸形成方面存在复合效应。其中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V组合在维持瘤胃pH值、稳定瘤胃内环境方面效果显著，是高精料条件下较为优良的酵母组合菌株。