基于代谢组学的西伯利亚白刺耐盐机理研究

冯帆，杨秀清，闫海冰

(山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801)

西伯利亚白刺 (NitrariasibiricaPall)，又名小果白刺，为蒺藜科(Zygophylaceae)白刺属(Nitraria)落叶小灌木[1]，该树种根系发达，多分枝、生长快、果实兼具食用和药用价值，枝、叶可作饲料，在我国西北部与北部地区的新疆、青海、宁夏、甘肃以及内蒙古等地区的盐碱地上多有分布，因此被认为是盐碱地生物改良的优良经济型树种资源[2,3]。中国目前17个省区都有盐渍土资源分布，总面积逾5亿亩。全球盐碱地面积也在逐年扩大，盐碱地己成为全球重要的后备土地资源[4]。利用耐盐碱植物改良土地盐碱化是提高盐渍化土地利用效率，并对土壤起持久改善作用的一项合理途径。对西伯利亚白刺进行耐盐机理研究，可为白刺有效应用于盐碱地改良和维持生态平衡提供重要依据，同时对白刺经济价值的发挥和扩大其资源利用具有重要意义。

关于白刺耐盐机理的研究，杨升等[5]通过测定盐胁迫后西伯利亚白刺幼苗体内脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱及矿质元素(尤其是Na+、K+和 Cl-)含量的变化，从生理角度揭示了这几种渗透调节物质对白刺耐盐能力的影响；张丽等[6]通过人工施盐的胁迫处理，从生理生化的角度表明白刺在盐胁迫下膜保护和修复能力均显著提高，体内有机渗透物质增加，降低细胞内水势，同时还可以通过叶片胞内的离子区隔化减少盐分对重要细胞器的损伤；程铁龙等[7]基于蛋白组学研究了盐胁迫后的西伯利亚白刺叶片,共检测到71种蛋白质的表达发生了显著变化，这些蛋白质参与的过程包括光合作用、碳水化合物和能量代谢，膜运输、信号转导及氧化还原反应等；Chen J等[8]鉴定出盐胁迫诱导产生的蛋白质，得出盐胁迫下光合作用的降低与参与光反应和卡尔文循环的酶、蛋白下调有关的结论。这些研究在不同水平上很好地揭示了西伯利亚白刺的耐盐机制，尤其是盐胁迫下体内蛋白质动态表达规律的分析将对西伯利亚白刺耐盐机理的认识深入到分子生物学的水平。但是，仅基于蛋白组学的研究并不能反映盐胁迫下白刺其他耐盐相关代谢产物的动态变化，对西伯利亚白刺耐盐相关代谢途径的认识尚属空白[9]。基于代谢组学的研究将有助于更深入的了解适应胁迫环境的分子机制。

鉴于此，本实验基于代谢组学的研究分析了西伯利亚白刺盐胁迫前后差异代谢物种类及含量的变化，找到参与胁迫应答的代谢途径，深入揭示其适应盐胁迫的代谢生物学机制，为西伯利亚白刺在盐碱地生物改良中的科学的资源利用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源及实生苗培育

白刺种子采自内蒙古巴彦淖尔市磴口县境内乌兰布和沙漠东北部(海拔1 036 m,N40°32′,E106°28′)白刺产地的野生种。果实采回后揉搓滤去果汁、果皮，洗净晾干，置于凉爽、通风、干燥条件下贮藏备用。

挑选饱满种粒于0.5‰KMnO4溶液中避光浸泡2 h，后于200 mg.L-1ABT1号溶液中预处理30 min，洗净后播于16 cm×14 cm规格装有纯净湿沙的营养钵中，每钵播种70粒，种植深度4 cm，共计6钵，置于光照培养箱中培养。培养箱设置光照时间14 h，光照强度1 200 Lux，温度27 ℃。试验过程中浇灌蒸馏水，浇水量为100 mL，每隔3天浇灌一次。

1.2 盐胁迫处理及取样

播种12天后种子发芽率为68.1%，待幼苗生长50天进行胁迫前取样，此时6个营养钵中正常生长的西伯利亚白刺幼苗共255株。每一营养钵中随机剪取白刺幼苗叶片100 mg，6钵共计6次重复，取下样品用锡箔纸包裹、编号，浸泡于液氮7 min后迅速取出置于-80 ℃冰箱备测。取样后立即进行胁迫处理，用300 mM NaCl溶液浇灌幼苗，每盆浇灌100 mL，每3天浇灌一次。为防止盐分流失，营养钵底部垫有塑料托盘，浇灌后渗出的溶液重新倒回营养钵内，同时定时记录白刺的生长状况。胁迫后第6天幼苗顶端的嫩叶边缘出现微黄甚至萎蔫，此时取胁迫后的样品，取样方法与胁迫前一致，对所取样品编号备测。

1.3 代谢物的提取及检测

取样本25±1 mg于2 mL EP管中，加入300 μL提取液(甲醇∶水=3∶1)，再加入5 μL核糖醇，涡旋30 s后低温离心15 min(12000 rpm转速)，移取200 μL上清液于1.5 mL EP管中，真空浓缩干燥提取物，向干燥后的代谢物中加入30 μL甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20 mg·mL-1)，混匀后放入烘箱中80 ℃孵育30 min，再向每个样品中加入40 μL BSTFA(含有1% TMCS,v/v)，70 ℃孵育1.5 h，冷却至室温，加入5 μL FAMEs。使用配有Agilent DB-5MS毛细管柱的Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪(30 m×250 μm×0.25 μm,J&W Scientific,Folsom,CA,USA)对样品进行GC-TOFMS检测。

1.4 数据处理及统计分析

使用ChromaTOF软件(V 4.3x，LECO)对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析[10]。在物质定性分析时，使用LECO-Fiehn Rtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配[11]，采用多元变量统计分析方法对代谢物进行筛选，并找出差异代谢物，利用富集分析和拓扑分析对差异代谢物所在通路进行综合分析，进一步确定西伯利亚白刺耐盐性相关差异代谢物及耐盐代谢通路。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下白刺叶片代谢物改变的应答及层次聚类分析

盐胁迫后西伯利亚白刺叶片中鉴定出差异代谢物共108种。除己内酰胺和黄烷腺嘌呤衍生物2种代谢物浓度显著下调外(下调浓度分别为3.18倍和4.22倍)，其余106种差异代谢物包括51种氨基酸类、22种糖类、11种脂肪酸类、8种有机酸类、7种醇类、5种生物碱以及2种维生素浓度均显著上调(上调范围在0.54倍和13.80倍之间)。其中上调浓度最大的代谢物为苯丙氨酸，上调浓度最小的代谢物为6-羟基己酸二聚物。显著上调的前10个差异代谢物见表(表1)。将已定性的108种差异代谢物进行层次聚类分析(图1)可知：层次聚类分析将这些代谢物主要分成了A和B两大类，其中A类包括生物碱和碱基衍生物，B类主要包括大部分氨基酸类、糖类、脂肪酸类、醇类、有机酸类、生物碱等。

表1 盐胁迫下西伯利亚白刺叶片中差异代谢物Table 1 Differentially expressed metabolites of Nitraria sibirica Pall under salt stress

注：Peak：定性得到的物质名称；Similarity：定性分析中该物质与标准库中物质的匹配程度，取值[0,1000],数值越高说明定性出的物质越准确；Rt：该物质的色谱保留时间；LOG_FOLDCHANGE：该物质对比两组实验间倍数关系以2为底的对数值，正号表示胁迫后较胁迫前的差异代谢物含量是显著上调关系，数值越大浓度上调越多。
Note：Peak：A qualitative description of the substance；Similarity：The matching degree between the substance and the standard substance in the qualitative analysis，The range is 0 to 1000，The higher the value,the more accurate the substance；Rt：The chromatographic retention time of the substance；LOG_FOLDCHANGE：The substance was compared between the two groups of experiments with the logarithm of base 2，The positive sign indicates that the difference of metabolite content after stress is significantly higher than that before stress，The higher the value,the higher the concentration.

图1 盐胁迫下西伯利亚白刺差异代谢物聚类分析图Fig.1 Hierarchical clustering analysis of differentially expressed metabolites of Nitraria sibirica Pall under salt stress

2.2 盐胁迫后西伯利亚白刺差异代谢物的代谢通路分析

盐胁迫后西伯利亚白刺叶片中浓度上调的106种差异代谢物经过富集分析和拓扑分析被注释到46条代谢通路中(图2)，其中参与到氨基酸生物合成代谢途径(图3)和苯丙氨酸代谢途径(图4)中的差异代谢物种类最多。被注释到氨基酸生物合成代谢途径中的与盐胁迫相关的差异代谢物有6种，分别为柠康酸、L-亮氨酸、3-异丙基苹果酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、丙酮酸；被注释到苯丙氨酸代谢途径中的与盐胁迫相关的差异代谢物也有6种，分别为苯丙氨酸、L-半胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺。乳糖、葡糖糖、木糖、阿洛糖主要参与糖降解、糖异生及半乳糖代谢过程。参与脂肪酸合成过程的代谢物主要包括棕榈酸、硬脂酸和肉豆蔻酸等饱和脂肪酸以及亚麻酸、亚油酸等不饱和脂肪酸。柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸主要参与TCA循环过程。此外，其余差异代谢物还参与苯丙类生物合成途径、嘌呤代谢、二羧酸盐代谢、戊糖和葡聚糖酸酯间转化代谢及氧化磷酸化过程等。同时，谷甾醇作为植物固醇的一种重要物质，其含量也显著上调，有利于维持膜的完整性。

3 讨论与结论

本实验鉴定到氨基酸类差异代谢物共51种。氨基酸是合成结构蛋白与应激蛋白的重要小分子物质，在植物的生命活动中承担着极为重要的生理作用[13]。在正常生长状态下，氨基酸、有机酸的含量往往很低，只有在逆境条件下这些有机物的含量才会上升，但他们本身并不会对植物的生长造成伤害[14]。Hare等[15]研究了盐胁迫条件下脯氨酸含量的变化，结果表明脯氨酸的积累有助于植物抵抗逆境环境。本实验结果显示，盐胁迫后西伯利亚白刺叶片中51种氨基酸差异代谢物的含量较胁迫前均显著上调，其中，脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、异亮氨酸等含量的上调范围均在2.07倍以上。脯氨酸的合成与降解会促进细胞质基质、线粒体的氧化还原反应及腺苷酸的合成，同时还可以作为碳、氮及其他细胞抵抗逆境所需能源物质的还原剂，这会提供给西伯利亚白刺叶片一个较高的逆境抵抗力，表明氨基酸在西伯利亚白刺体内抵抗盐胁迫、维持稳态方面发挥了重要的作用。

图2 盐胁迫下西伯利亚白刺代谢通路分析气泡图Fig.2 Metabolic pathway analysis of Nitraria sibirica Pall under salt stress注：气泡图中每一个气泡代表一个代谢通路，气泡所在横坐标和气泡大小代表该通路在拓扑分析中的影响因子，气泡越大影响因子越大；气泡所在纵坐标和颜色表示富集分析的P值，颜色越深P值越小，富集程度越显著。Note：Each bubble represents a metabolic pathway in the bubble map,The abscissa and bubble size represent the influencing factors of the path in topological analysis,The bigger the bubble,the bigger the impact factor;The ordinate and color of the bubble represent the P values for enrichment analysis,The darker the color,the smaller the P value,The higher the enrichment degree is.

图3 氨基酸生物合成途径Fig.3 Biosynthesis of amino acids pathway

图4 苯丙氨酸代谢途径Fig.4 Phenylalanine metabolism pathway

植物体内糖类的形成、转运、贮藏和消耗与植物生理代谢对外界的响应有紧密地联系，逆境条件会影响植物体内糖代谢途径，因此，可以用糖代谢水平来衡量环境对植物的胁迫程度及植物对逆境环境适应性的强弱[16]。黄相玲等[17]研究了小叶榄仁幼苗对盐碱环境的适应机理，结果表明，在0.6%～1.0%盐胁迫下，可溶性糖含量随盐浓度的升高呈递增趋势。本实验中，胁迫后西伯利亚白刺叶片中包括乳糖、阿洛糖、赤藓糖、海藻糖、脱水半乳糖、景天庚酮糖等在内的22种糖类的含量较胁迫前均显著上调，这些糖类代谢物主要参与糖降解、糖异生及半乳糖代谢途径，在参与西伯利亚白刺的盐胁迫应答过程中，除了可以作为渗透调节物质外，所参与的这些代谢过程中还会释放大量ATP可为白刺抵抗盐胁迫环境提供重要能量。

脂肪酸是植物体内一类重要的生物活性物质，其不仅是细胞膜脂的重要组成成分，还是生物体贮藏能量的主要来源[18]。张婧[19]通过比较中性盐胁迫下两种大豆的生长参数，表明大豆的耐盐能力主要是依靠脂肪酸等小分子渗透调节物质的积累。在胁迫后西伯利亚白刺叶片中检测到11种脂肪酸，其中棕榈酸和亚麻酸的浓度上调最为显著，参与的代谢途径主要是脂肪酸合成过程，通过合成脂肪酸来维持膜结构的完整性，从而提高西伯利亚白刺的耐盐性。

TCA循环不仅可为植物生命活动提供能量，而且还将糖类、脂类及蛋白质代谢紧密联系在一起，同时，TCA循环产生的许多中间产物也是植物体内许多重要物质的合成原料[20]。代谢通路分析可知，盐胁迫条件下西伯利亚白刺叶片中柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸及苹果酸等代谢物含量均显著上调，表明盐胁迫条件下白刺叶片中TCA循环显著增强，这为其抵抗盐胁迫提供了更多的能量，同时又将代谢组的多个耐盐相关代谢物联系起来，成为西伯利亚白刺耐盐机制的重要组成部分。

盐胁迫条件下西伯利亚白刺叶片中氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢均参与渗透调节，TCA循环过程也显著增强，说明西伯利亚白刺不仅依靠糖代谢及TCA循环过程产生能量，还通过积累渗透调节物质以适应不良环境，西伯利亚白刺耐盐机制较为完善。