基于PCR技术的鹿源性产品成分分子检测研究进展

董世武，王天娇，张然然，唐丽昕，邢秀梅

（中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物重点实验室，长春 130112）

鹿全身均可入药，鹿产品更是多种多样，且价格昂贵。我国历代本草著作及现代药典都将梅花鹿（Cervus nippon）和马鹿（C.elaphus）的产品视为正品，其他鹿种的产品则多作为代用品、习用品或伪品[1]。由于产品在加工过程中其形态结构、理化性质等均有不同程度的改变，传统方法难以对产品的成分进行准确定性。分子检测方法反应灵敏，准确度高，给鹿源性产品成分的定性分析提供了技术支持。关于鹿科动物线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）的研究报道较多[2]，因而分子检测方法大多利用种属间mtDNA的差异进行检测，主要有细胞色素 b（Bytochrome b，Cytb）基因、细胞色素C氧化酶I（COⅠ）基因以及12S rRNA，还有少数方法是基于Y染色体SRY基因的差异进行检测。微卫星DNA（Microsatellite DNA）和单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）作为分子标记，是分子检测的有力工具。本文将近年来有关鹿源性产品成分分子检测的研究进行综述。

1 基于mtDNA的检测研究

mtDNA为母系遗传，突变率高，自发突变率超过nDNA（Nuclear DNA）约 20 倍[3]。

1.1 Cytb基因

Cytb基因在线粒体基因组中有着适中的进化速度，其一个小片段就能包含大量的系统发育信息，被广泛应用于物种鉴定[4-5]、系统发育关系以及遗传多样性研究[6-7]等。在鹿源性产品成分的检测应用中，根据梅花鹿和马鹿与其他物种之间Cytb基因序列的差异设计特异性引物，进行PCR扩增和电泳检测，从目的片段大小、数目等的差异对样品进行区分鉴定，不仅简单快速，而且反应灵敏、准确性高。结合随机扩增多态性DNA标记（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）[8]、单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism，SSCP）[9]、限制性内切酶片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）[10-11]等技术，在鉴别鹿产品真伪的同时，还能够将梅花鹿源成分及马鹿源成分准确区分，为鹿产品的质量控制提供了有效的技术手段。

在常见肉制品的鉴定中，用Cytb基因通用引物对肉制品中提取的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，并将序列与GenBank的已知序列进行对比分析，即可达到鉴定肉制品真伪的目的[12]。根据不同种动物Cytb基因的差异建立PCR种属鉴别体系，结合常规琼脂糖凝胶电泳，即可快速、准确区分体系中的物种，其中，对牛、牦牛、山羊DNA检测的灵敏度在2.5 ng左右[13]。

1.2 COⅠ基因

COⅠ基因为线粒体基因组的蛋白质编码基因，负责编码细胞色素C氧化酶的一个强疏水性核心亚基--细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ[14]。作为DNA条形码基因，COⅠ是目前物种鉴定常用的基因之一，而DNA条形码技术则是对传统形态学鉴定方法的有力补充[15]。在鹿产品成分的鉴定中，张蓉等[16]和崔丽娜等[17]均利用COⅠ序列的通用引物对鹿科不同种属动物的鹿茸DNA进行扩增和测序，构建的系统进化树可以明显区分正品鹿茸与其混伪品，证实该方法可用于鹿茸的真伪鉴定。刘冬等[18]基于COⅠ序列建立了鹿类药材的分子鉴定方法，结果，所有鹿类药材均可用COⅠ通用引物PCR扩增并测序，且数据库中8种101份样品物种间区分明显，为市售鹿类药材的鉴定提供了科学依据。高晓晨等[19]基于该方法对40份市售鹿茸饮片进行鉴定分析，正品仅占35%，其余65%均来源于驯鹿。贾静等[20]对市售鹿茸药材粉末样品中获得的COⅠ序列进行分析，65份样品中38%为正品，62%为驯鹿为主的其他基原样品，另外35份样品中主要基原为梅花鹿或马鹿，且存在以马鹿茸粉冒充梅花鹿茸粉的现象。

在常见动物（牛、羊、猪、鸡等）肉产品的分子鉴别中，COⅠ同样能有效发挥其条形码基因的作用，且鉴别成本低、速度快[21-22]，为动物源性食品的检测提供了参考。

1.3 12SrRNA

12SrRNA位于mtDNA上的非编码区，在动物源性成分的检测鉴定、产品真伪鉴别上均有应用。Wang等[23]利用12S rRNA加荧光标记，结合T-RFLP技术对12种动物肉（包括鹿肉）进行鉴定研究，结果该方法具有潜在的快速、准确鉴别动物种类的可行性和适应性。Mohan等[24]对鼷鹿的12SrRNA进行了分析，并用通用引物进行了PCR扩增，经限制性酶切后进行克隆和测序，可将鼷鹿与其他鹿种明确区分。白根本等[25]用通用引物对国内梅花鹿、马鹿等11种鹿的12SrRNA基因片段进行分析，设计了1对高特异性引物鉴别梅花鹿和马鹿，结果12S rRNA片段可在种的水平上将不同的种区分，设计的特异性引物可准确区分梅花鹿和马鹿。由此可见，12SrRNA在物种鉴定方面同样有着重要的应用价值。

2 基于SRY基因的检测方法

SRY基因也称为Y染色体性别决定区，已被应用于马鹿的遗传多样性研究[26]。魏艺聪等[27]用SRY基因作为父本标记，同时以COⅠ基因作为母本标记，对已知样本的SRY基因和COⅠ基因进行测序分析，建立了双位点特异PCR体系，用于梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的鉴别，其判定标准见表1。用该方法对已知样品进行检测，8个梅花鹿样品、7个马鹿样品和5个马 花杂交鹿样品均呈阳性反应，而驯鹿、水鹿等样品则呈阴性反应。

表1 样品判定标准Table 1 The judgement standards of samples

3 microsatellite DNA的应用

microsatellite DNA又称为STR（Short tandem repeat，STR），即短串联重复序列，重复单元为1～6个核苷酸，组成的重复序列可达几十个核苷酸，具有种属和碱基组成的特异性[28]，在揭示物种遗传多样性[29-31]、遗传特征和群体结构分析[32]、基因分型[33]、物种鉴别[34]以及动物亲缘关系鉴定[35]中均有应用。Zachos等[36]首次利用核标记从13个微卫星位点对欧洲分布范围内大部分地区的600多头马鹿进行了分析，计算其遗传多样性和有效种群大小时产生了最小的结果，与这些群体已知的瓶颈一致。在梅花鹿、马鹿产品源性成分的鉴定上，尚未见到有关STR应用的报道。

4 SNP的应用

SNP作为分子标记，在许多物种应用中表现出可靠性、敏感性和高度的信息含量[37-39]。Ba等[40]使用双消化限制性酶切位点相关DNA测序技术（ddRAD-seq），从30个圈养个体（7个梅花鹿、6个马鹿和17个F1杂交种）中检测到约32万个全基因组SNPs，通过筛选4个分类群体中每个SNP的杂合度，首次报道了2 015个假定的诊断性SNP标记（用于梅花鹿和马鹿的物种特异性SNP）的资源，可用于梅花鹿与马鹿之间杂交程度的评估或监测，为全基因组的研究提供了宝贵资源；在42个不相关的个体（来自8个鹿场）[41]中产生了超过14.5亿的高质量配对读数（288 Gbp），开发的一系列高质量的SNP探针可能在将来用于鹿科物种基因分型。

5 小结

分子检测方法大部分都是建立在PCR基础上的，包括 PCR-RAPD[8]、PCR-SSCP[9]、PCR-RFLP[10-11]、RT-PCR（Real Time-PCR）[42-43]、Nano-PCR[44]以及LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[45]等，其原理是根据不同物种之间DNA序列的差异，设计特异性引物进行PCR扩增，然后直接对PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带的差异对样品进行区分，或者结合酶切等技术，使难以区分的PCR产物产生不同大小及数目的片段，从而对样品进行区分；直接对PCR产物进行测序，然后与已有物种的相同区域的DNA序列进行比对与聚类分析，以达到鉴别目的。mtDNA在种内相对保守，而种间差异较为明显，因而被作为分子检测的目的基因广泛应用。微卫星和SNP分子标记虽然也是分子检测方法的有力工具，但在鹿产品鉴别的应用中还有待开发。

朱云飞等[46]对梅花鹿、马鹿、驯鹿和新西兰赤鹿的鹿茸蛋白进行分析，结果鹿茸蛋白条带有15条，在7.5%分离胶系统中分别在34、35 ku处梅花鹿排血纱片有明显条带，147、142、138 ku处仅新西兰赤鹿有蛋白条带，这为不同品种鹿茸的定性研究提供了依据和基础，但在产品加工过程中蛋白质容易遭到破坏，导致该方法的适用性较差。分子检测方法反应灵敏、准确度高，能够弥补利用蛋白差异进行检测的不足，但在效率、成本等方面还有相当大的改善空间。随着测序技术的发展及测序成本的降低，未来分子检测方法的应用将更加广泛，这对于维护市场秩序和保证消费者权益具有重要意义。