狐狸三聚氰胺和三聚氰酸混合物急性中毒及蓄积毒性

李海涛，刘艳环，张斌，苗利光※，赵冬凤

（1.中国农业科学院特产研究所农业部经济动物疫病重点实验室，长春 130112；2.石家庄市兽用生物制品供应站，石家庄 050000；3.廊坊职业技术学院，河北 廊坊 065000)

三聚氰胺（Melamine，MA）是一种三嗪类杂环有机化合物，遇强酸和强碱后水解为三聚氰酸（Cyanuric acid，CYA）。三聚氰胺和三聚氰酸不属于饲料原料和饲料添加剂，但是由于其含有66.7%的氮，被违法添加，以增加饲料中表观蛋白氮的含量[1]。近年来，工业污染、环境富集导致饲料和兽药原料污染，这两种化学物质被不断发现在饲料和兽药中，威胁动物健康、构成动物生产安全隐患。三聚氰胺和三聚氰酸两者单独存在时对动物机体的毒性不大，但是混合后对动物机体造成的损伤程度加大，尤其是高剂量暴露时，短时间内沉积在肾小管，造成肾结石或者肾毒性的发生[2]。本研究通过三聚氰胺和三聚氰酸混合物对狐狸大剂量暴露的动力学试验，掌握三聚氰胺和三聚氰酸混合物在狐狸体内的代谢规律及对肝脏、肾脏的损伤程度，为评估狐狸三聚氰胺和三聚氰酸混合物中毒提供科学依据。

1 材料

1.1 试剂和仪器

三聚氰胺和三聚氰酸（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；一次性静脉采血针、肝素抗凝采血管（江苏康健医疗用品有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia公司）；氨水、乙酸铅、三氯乙酸（分析纯，北京化学试剂公司）；柠檬酸、辛烷磺酸钠（分析纯，Sigma公司）；其他试剂均为国产分析纯。

Dionex Summit HPLC系统、Acclaim混合基质柱WAX-1（戴安公司）。

1.2 试验动物和分组

动物试验在河北省冀东动物养殖有限公司进行。选择体重接近的成年雄性狐狸12只，品种一致，健康状况良好。试验狐狸随机分为4组，每组3只。Ⅰ组为阴性对照组，Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组口服不同浓度的三聚氰胺和三聚氰酸混合物，见表1。染毒前动物饲养在动物舍内适应5～7d，使其适应环境，自由饮水和采食，按标准正常饲养。试验组动物于空腹12 h后染毒。

表1 各组口服三聚氰胺和三聚氰酸的浓度Table 1 The concentrationsof oral melamine and cyanuric acid in each group （mg/Kg）

2 方法

2.1 中毒模型的建立

建立中毒模型前，对试验用狐狸进行分组编号，并观察和记录狐狸的基本状态，包括体重、体温、精神状态及黏膜状态。使用保定器械对动物进行固定，将三聚氰胺和三聚氰酸与饲料混合后口服。记录染毒时间，并观察、记录动物的状态和临床症状。

2.2 临床指标观察

详细观察和记录动物染毒前、后中毒症状出现的时间及临床症状，包括呼吸状态、体温变化、排尿状况、排便状况、精神、行为等。染毒后进行临床观察至染毒后48 h，每天观察2次（间隔12 h），包括食欲、精神状态、呼吸、鼻腔分泌物、尿液、粪便等。

2.3 样本采集

攻毒前2 h试验动物静脉采集抗凝血3 mL，收集尿液3 mL，粪便100 g。

染毒后 0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h 静脉采血 3 mL，抗凝处理，分离血浆，冷藏待检。染毒后1h、4h、12h、24 h收集尿液。

染毒后48 h，安乐死处理试验动物，进行病理解剖。取肾脏和肝脏，冷冻后待检。

2.4 三聚氰胺和三聚氰酸检测

对收集的血样、尿样、粪样和组织器官样本，使用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法进行三聚氰胺和三聚氰酸检测[3-5]。

3 结果

3.1 狐狸染毒前、后临床症状

对12只狐狸体重、体温、精神状态及粪便进行了染毒前、后检查。染毒前，各组动物的体温正常，平均体温为（39.0±0.2）℃；体重基本一致（10±0.5）Kg；精神状态良好；呼吸、排尿和排粪正常，符合试验要求。

染毒后，Ⅰ组阴性对照动物未见明显异常临床症状；Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组染毒后6h动物相继出现食欲降低、呼吸急促、不安定的临床症状。

3.2 狐狸染毒后病例变化

试验结束时，对所有动物进行解剖检查，Ⅰ组阴性对照动物剖检和病理切片检查肝脏、肾脏未见明显异常。Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组试验组肝脏、肾脏均有不同程度肿胀，颜色变淡，同时，将肾脏和肝脏组织进行石蜡包埋后制作病理切片，观察肾小球、肾小管、肝细胞、肝窦和肝血管病理变化，结果发现，染毒动物的肝脏细胞有轻度肿胀，细胞索有异常变化，肝血管内有异物（图1）；肾脏中肾小球、肾小管病变明显，肾小球坏死，肾小管壁损伤，管腔内有异物（图2）。

图1 肝脏组织病理学变化Fig.1 Histopathological changes in the liver Green arrows.

图2 肾脏组织病理学变化Fig.2 Histopathological changes in the kidney

3.3 三聚氰胺和三聚氰酸残留检测

采集血样、尿样、肝脏和肾脏样品，LC-MS方法检测三聚氰胺和三聚氰酸残留。Ⅰ组阴性对照动物的血浆、尿液、肝脏和肾脏中未检出三聚氰胺和三聚氰酸残留；Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组动物中的血浆、尿液、肝脏和肾脏中有不同程度的三聚氰胺和三聚氰酸残留。血浆中的三聚氰胺和三聚氰酸残留在染毒后0.5 h可以检测出，在染毒后2h达到了残留最高值，然后随着代谢过程，残留在逐渐减少，至染毒后24h残留值已降低至较低水平（图3、图4）。尿液中的三聚氰胺和三聚氰酸残留代谢变化趋势与血浆中的残留变化趋势相近，在染毒后2 h达到了残留最高值，且染毒后各时间点的残留值均比血浆中的高（图5、图6）。试验结束后，对所有动物进行解剖，采集肝脏和肾脏，并对肝脏和肾脏中三聚氰胺和三聚氰酸残留进行检测，结果显示，随着染毒剂量的增加，肝脏和肾脏中的残留值越高，且各组中三聚氰酸的残留值大于三聚氰胺（图7）。

图3 三聚氰胺在血浆中的残留Fig.3 MA residues in plasma

图4 三聚氰酸在血浆中的残留Fig.4 CYA residues in plasma

图5 三聚氰胺在尿中的残留Fig.5 MA residues in urine

图6 三聚氰酸在尿中的残留Fig.6 CYA residuesin urine

4 讨论

三聚氰胺在动物体内属于惰性代谢。Mast等[6]给予Fischer 344大鼠口服单剂量14C标记的三聚氰胺0.38 mg，进入体内后很快由尿排出；被摄入的三聚氰胺90%在第1个24h内被排出，有极少部分由呼吸和粪便排出；三聚氰胺在血中、肝脏内和血浆中的浓度基本相同，表明其是在体液中分布的。在肾脏和膀胱处用14C测得的放射性水平较血浆中高，膀胱内最高，这可能是由于尿液的反向弥散作用，也可能是由于尿液对膀胱组织的污染所致。24 h及24 h之后未再观察到各种组织内有残余的放射性。

目前认为，三聚氰胺诱发的结晶形成可能与三聚氰胺和三聚氰酸在尿液中形成的不溶性三嗪复合物有关，在酸性环境中，三聚氰胺和三聚氰酸容易生成不溶性盐而引发结晶形成，而在碱性环境下，不溶性结晶易于溶解排出[7，8]。因摄食习性不同，肉食性动物猫、狗和狐狸尿液呈酸性，杂食性动物大鼠和猪尿液呈中性，而食草性动物牛和羊尿液呈碱性，这种不同动物种属尿液pH值的差异可能是三聚氰胺毒性的物种感受性差异原因之一。

本研究通过口服三聚氰胺和三聚氰酸混合物对狐狸大剂量暴露的动力学试验，对三聚氰胺和三聚氰酸混合物在雄性狐狸血液、尿液、肝脏和肾脏组织内的代谢规律及对肝脏、肾脏的病理损伤程度进行了分析和评估。研究表明，三聚氰胺和三聚氰酸混合物在体液中的代谢变化趋势较为一致，说明三聚氰胺和三聚氰酸主要代谢途径为体液，然后到达肝脏和肾脏沉积，造成肝脏和肾脏的病理学损伤。本试验为评估狐狸三聚氰胺和三聚氰酸混合物中毒提供科学依据。