薄层数码成像法检测酒中氨基甲酸乙酯

黄秋婷，王 浩，黄惠华

（1.广州市食品检验所（广州市酒类检测中心），广东广州511400；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510641）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是食品在发酵过程中产生的物质，在20世纪40年代，EC被发现具有致癌性，引起了各国对发酵食品中EC含量的重视[1]。酒中的EC主要是在发酵过程中，精氨酸的代谢物（尿素、瓜氨酸等氨基甲酰类化合物）与乙醇反应产生[2]。考虑到酒类食品是人类摄入EC的主要来源，部分国家对酒类食品中的EC含量进行了限定，如加拿大、法国、捷克规定蒸馏酒中EC的限量为150 μg/L，德国、瑞士对白兰地中EC的限量分别为800 μg/L和1000 μg/L。

目前国内外对酒中EC的检测主要采取气相色谱-质谱法。对于成分复杂、EC含量低的酒类样品，需要采取不同的萃取和浓缩方式，以减少干扰，提高方法灵敏度[3-7]。此类分析方法准确度高，但存在设备昂贵、前处理复杂、检测时间长、对人员要求高、检测成本高等缺点。本实验采用薄层层析的方法，样品无需经过前处理，直接点样，结合数码成像技术，使用MATLAB软件[8]对斑点的灰度值进行定量计算，以达到快速测定、降低检测成本、简化分析流程的目的。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：40%vol白酒，购自超市。

试剂及耗材：氨基甲酸乙酯标准样，纯度99%，购自阿拉丁公司，实验时用40%无水乙醇（体积比）作溶剂配制标准液；肉桂醛，色谱级，购自阿拉丁公司；其余试剂如磷酸、丙酮、甲基叔丁基醚、正己烷、甲醇、无水乙醇等，均为分析纯。

仪器设备：实验室自制浸板机；MATLAB软件；ZF-90D暗箱式紫外分析仪，上海光豪分析仪器有限公司；尼康L330数码相机；100×100 mm双槽展开缸；50×100 mm GF254薄层硅胶板，青岛谱科分离材料有限公司；10 μL微量进样针，上海安亭微量进样器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 展开条件

薄板层析展开剂的配制：甲基叔丁基醚∶正己烷∶甲醇（5∶7∶2），充分混合均匀后倒入展开缸的一侧。在有展开剂的一侧放入薄层板，当展开剂前沿到达标线后取出薄层板，在通风柜中晾干。

1.2.2 薄层数码成像系统组装及使用参数

将尼康L330数码相机安装在ZF-90D暗箱式紫外分析仪的固定支架上，构成一套用于获取数字图像的装置，紫外灯波长为365 nm，数码相机拍摄参数设置：尺寸2272×1704，曝光时间1 s，ISO速度ISO-200，焦距9毫米，最大光圈3.3，35 mm焦距52，场景为自动模式，白平衡为荧光灯，色彩选项为标准色彩。

1.2.3 薄层显色实验步骤

将新购置的薄层板在烘箱中105℃活化30 min后放于干燥器中冷却备用。在距薄层板端部10 mm，距侧面10 mm处点样，在距另一端20 mm处划线，作为展开结束的标线。点样结束后按照1.2展开条件操作。使用实验室自制浸板机，使薄层板与衍生液接触。将完成浸板操作的薄层板置于温度已达到125℃的烘箱中反应，10 min后取出薄层板。待薄层板冷却后进行拍照，使用MATLAB软件对获取的数字图像上的EC荧光斑点积分定量。

1.2.4 MATLAB积分定量操作步骤

打开MATLAB，使用imread命令读取拍摄好的数字图像；将数字图像的红色通道和蓝色通道矩阵设置为零矩阵；使用imcrop命令截取有斑点部分的数字图像，图像像素大小为400×200；使用rgb2gray命令将截图的绿色通道图像转化为灰度图；使用wiener2命令去除灰度图上的噪声；使用imadjust命令，将图像中1%的数据饱和至最低和最高亮度，保存变换后的图像；使用im2bw命令，调整阈值，使得获得的二值图像的斑点轮廓足够接近上一步变换后图像的最高亮度区域，保存调整好的二值图；将二值图与去噪后的灰度图矩阵点乘，得到需要定量的斑点；使用fliplr命令获得去噪灰度图的镜面图像，将该图像与二值图矩阵点乘，得到同样斑点大小的背景图像；将斑点灰度值积分减去背景灰度值积分之后除以斑点像素个数，得到平均灰度值（平均GL），该值作为后续的定量指标。

1.2.5 衍生显色单因素实验

实验中使用的EC浓度为10 mg/L，点样量为10 μL，即在斑点上的EC点样量为100 ng/点。衍生液溶剂丙酮定为40 mL，肉桂醛250 μL，磷酸2.4 mL。实验室自制浸板机的浸渍时间默认为3000 ms。

1.2.5.1 肉桂醛含量的优化

分别向肉桂醛含量为50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL、450 μL、500 μL的10组烧杯中加入40 mL丙酮和2.4 mL磷酸，充分混合均匀后备用。按照步骤1.2.4操作，每个含量做3个平行样，比较平均灰度值。

1.2.5.2 磷酸含量的优化

分别向含有肉桂醛250 μL的丙酮溶液中加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL磷酸，充分混合均匀后备用。按照步骤1.2.3操作，每个含量做3个平行样，比较平均灰度值。

1.2.5.3 浸板时间的优化

配制的肉桂醛衍生液，更改实验室自制浸板机的浸渍时间分别为 1000 ms、2000 ms、3000 ms、4000 ms、5000 ms。按照步骤1.2.3操作，每个含量做3个平行样，比较平均灰度值。

1.2.5.4 反应温度的优化

配制肉桂醛衍生液，更改烘箱温度分别为90℃、100℃、110℃、120℃、130℃。按照步骤1.2.3操作，每个含量做3个平行样，比较平均灰度值。

1.2.5.5 反应时长的优化

配制肉桂醛衍生液，更改薄层板加热时间分别为 4 min、6 min、8 min、10 min、12 min。按照步骤1.2.3操作，每个含量做3个平行样，比较平均灰度值。

1.2.6 方法学考察

根据单因素得出的最优反应及操作条件，进行方法学上的考察。

1.2.7 精密度

使用5 mg/L的EC标准液，在5块5×10 cm薄层硅胶板点样，点样量都为10 ng/点。按照上述实验步骤和最优的操作条件，得到斑点平均灰度值。

1.2.8 斑点稳定性

在1块5×10 cm薄层硅胶板上点样，点样量为50 ng/点。按照上述实验步骤和最优的操作条件，以薄层板从烘箱拿出立即拍照为0 min，每隔1 min拍照1次，计算斑点的平均灰度值。

1.2.9 标准曲线绘制

使用10 mg/L的EC标准液，在薄层板上点样，分别为 8 ng/点、10 ng/点 ng/点、12 ng/点、14 ng/点、16 ng/点、18 ng/点。按照上述实验步骤和最优的操作条件，得到斑点平均灰度值。

1.2.10 加标回收率

在4块5×10 cm薄层硅胶板点样，点样量分别为10 μL酒样、10 μL酒样+4 ng EC标品、10 μL酒样+6 ng EC标品、10 μL酒样+10 ng EC标品。按照上述实验步骤和最优的操作条件，得到斑点的平均灰度值，根据标准曲线计算EC含量的加标回收率。

1.2.11 检出限的确定

对10 mg/L EC标准溶液进行6次测定，在5×10 cm薄层硅胶板上的点样量都为8 ng/点，获得测定结果的标准差S，查出相应的t，检出标准=t空白S空白，按公式（检出限=检出标准+St）计算检出限。

1.2.12 数据统计分析

所有实验进行3次重复，取平均值并计算标准偏差，采用SPSS 18.0统计分析软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 衍生显色单因素实验结果

2.1.1 肉桂醛含量的影响（图1）

图1 肉桂醛含量对灰度值的影响（n=3）

当衍生液中的肉桂醛含量为250 μL时，斑点的平均灰度值为最大，而随着肉桂醛含量的增加，背景平均灰度值始终增加。当肉桂醛含量增加超过250 μL后，背景灰度值继续增加，而此时斑点衍生反应已充分，亮度不再增大，且有可能影响斑点荧光产生，最终得到的平均灰度值下降，因此肉桂醛的最优使用量为250 μL。

2.1.2 磷酸含量的影响（图2）

当衍生液中的磷酸含量为3 mL时，斑点的平均灰度值为最大，而随着磷酸含量的增加，背景平均灰度值增加且趋于稳定。当磷酸含量超过3 mL后，可能多余磷酸的存在对荧光斑点亮度产生了抑制，最终得到的平均灰度值下降，因此磷酸的最优使用量为3 mL。

2.1.3 浸板时间的影响（图3）

图2 磷酸含量对灰度值的影响（n=3）

图3 浸板时间对灰度值的影响（n=3）

当接触时间在3～4 s，斑点的平均灰度值为最大。随着接触时长的延长，背景平均灰度值增加，但当超过4 s后，灰度值下降。从3 s到4 s，背景的灰度值增加，而斑点的平均灰度值基本不变，说明在1 s内，增加了衍生液与薄层板接触的机会，但4 s后，背景平均灰度值下降，可能是过长的接触时间，使得薄层板的硅胶成分脱落，为了使衍生液充分接触薄层板且不使硅胶脱落，因此选择浸板操作的时间为4 s。

2.1.4 反应温度的影响（图4）

图4 反应温度对灰度值的影响（n=3）

当反应温度在120℃时，斑点的平均灰度值为最大，反应温度的提升超过120℃后，背景平均灰度值继续增加，而斑点的平均灰度值下降，因此最优的反应温度是120℃。

2.1.5 反应时间的影响（图5）

图5 反应时间对灰度值的影响（n=3）

当反应时间在12 min时，斑点的平均灰度值为最大，继续延长时间对背景亮度产生有反作用，在实测中发现，经14 min加热后，365 nm下薄层硅胶板整体红色最为明显，可能是过长时间的加热使硅胶板表面氧化加剧，因此，选择最优的反应时间为12 min。

2.2 方法学考察实验结果

2.2.1 精密度和斑点稳定性（图6、图7）

图6 精密度结果（n=5）

图7 斑点稳定性结果

图6为10 ng/点样品在5块不同的5×10 cm薄层硅胶板按相同最佳操作得到的结果，其中平均GL的RSD为9.70%（n=5），平均背景GL的RSD为2.42%（n=5）。可见方法在不同薄层硅胶板上的重复性较好，造成点样量相同但结果不同的原因可能是在点样时，由于人工的操作失误，斑点点样不是非常均匀，也可能是购买的薄层板不是每一块都均匀等因素导致。

图7为50 ng/点的样品每隔1 min拍照分析得到的斑点灰度值，可见在2 min后50 ng含量的EC斑点的平均GL趋于稳定，灰度值为18。

2.2.2 相关性、加标回收率和检出限的确定

在最佳实验条件下，在薄层板上点不同含量的EC，将实验结果作图，获得相应的工作曲线，方法的线性拟合方程为y=0.742x-3.3248，相关系数R2=0.992。

加标回收率实验中，进行分别加入0、4 ng、6 ng、10 ng的实验。实验测得的平均GL值分别为2.4877、5.0015、5.7005、6.9492。4 ng、6 ng、10 ng的加标回收率分别为84.70%、72.17%、60.12%。

由于本方法是通过肉眼确定斑点是否存在，再用软件积分计算，当不可见斑点时，空白SD值即为0，则检出限为0.595 mg/L。检出限的实验结果见表1。

表1 DE-TLC方法测定氨基甲酸乙酯的检出限

3 结论

使用薄层数码成像技术实现了对氨基甲酸乙酯定量分析，通过研究衍生显色中的单因素，确定了方法的最优衍生条件，40 mL丙酮中，肉桂醛含量250 μL、磷酸含量3 mL、浸板时间4 s、加热温度120℃，加热时间12 min。采用最优条件对薄层成像法定量EC进行了方法学上的考察，不同薄层板上斑点的RSD=9.70%（n=5,10 ng）；烤板结束2 min后，斑点的平均灰度值趋于稳定；当EC含量在8～18 ng/点的范围内，其含量与平均GL呈线性关系，相关系数R2=0.992，检出限为0.595 mg/L，样品加标回收率在60.12%～84.70%。