气相色谱-串联质谱法测定鲜香菇中25种有机磷类农药残留

戚文华　李莺　王毅红

摘    要： 建立了气相色谱-串联质谱测定香菇中25种有机磷农药残留的检测方法。样品用氯化钠、乙腈提取，C18分散固相萃取净化。采用EI源电离多反应监测（MRM）模式进行检测，基质标准溶液校正，外标法定性、定量。分别讨论了氯化钠加入先后顺序对提取效果的影响和C18的用量对净化效果的影响。结果表明，25种化合物色谱峰分离度高，在各自的线性范围内线性关系良好（r2 >0.99），在3个添加水平下的平均回收率为70.7%～116.6%，相对标准偏差（RSD）为4.4%～14.0%，方法的定量限为0.002～0.010 mg·kg-1。该方法简单、快速，能保证批量样品连续检测的稳定性，适用于香菇样品中多种有机磷类农药残留的同时检测。

关键词： 振荡超声提取; C18分散固相萃取; 气相色谱串联质谱; 有机磷农药

Determination of 25 organophosphorus pesticide residues in shiitake by gas chromatography-tandem mass spectromety

QI Wenhua，LI Ying，WANG Yihong

（Zhengzhou Agricultural Product Quality Testing Center， Zhengzhou 450006，Henan， China ）

Abstract： A method was developed for the determinations of 25 organophosphorus pesticides in shiitake using gas chromatography-tandem mass spectrometry technique. The sample ware extracted by sodium chloride and acetonitrile. Then the extracts were purified by dispersive solid phase extraction with C18. The solvent extracts were analyzed by GC-MS/MS in the EI ion mode and multiple reaction monitoring（MRM）mode. The matrix standard solutions were used for calibration. External standard was used as the qualitative and quantitative method. The extraction effect of NaCl addition sequence and the purification effect of C18 dosage were discussed respectively. The results showed that 25 pesticides had good linearity within their respective linear range （r2 > 0.99），the average recoveries at three spiked levels ranged from 70.7 % to 116.6 % with the relative standard deviations（RSDs）from 4.4 % - 14.0 %. The limits of quantification of this method were in the range of 0.002 - 0.010 mg·kg-1. This method is simple，quick and has a good stability of the continuous batch analysis. It is suitable for determination of multiple organophosphorus pesticides in shiitake simultaneously.

Key words： Vortex and ultrasonic extraction; C18 dispersed solid phase extraction; Gas chromatography-tandem mass spectromety （GC-MS/MS）; Organophosphorus pesticides

香菇以其豐富的营养、宜人的味道[1]，受到越来越多人的青睐。我国香菇的种植面积也在逐年增加，但目前针对食用菌中农药残留检测的标准较少[2]，GB 2763-2016《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中食用菌检测方法大多情况要求参照蔬果类相关标准进行检测[2-4]。NY/T 761—2008《方法一 蔬菜、水果中有机磷类农药残留检测 GC-FPD法》做蔬果中有机磷类农药残留检测不仅前处理步骤简单易行，且GC-FPD仪器操作容易、选择性强、灵敏度高，检测成本低，检测结果准确可靠，所以发布至今依然是蔬果中有机磷类农药残留定量检测的首选方法[5]。但用此方法进行香菇中有机磷类农药测定时，大多数样品会出现严重的基质干扰，影响目标物色谱峰的定性定量[6-8]。

目前有关香菇中农药残留检测的研究论述仍较少，其中以Quechers前处理-GC-MS/MS或LC-MS/MS 上机的检测方法较新[7]，提取中多采用MgSO4除水，PSA+C18净化[7，9-15]。但无水硫酸镁遇水会大量放热易使农药分解，放热过程不易控制[16]，且C18单独使用的净化效果未见报道。

笔者采用氯化钠、乙腈为提取试剂，选择甲胺磷等禁用、限用，甲基异柳磷等LC-MS/MS上响应差，敌百虫等GC-MS/MS上不好测定的25种有机磷农药为研究对象，讨论了振荡超声提取法的提取效率，考察了C18的净化效果，建立了分散固相萃取结合GC-MS/MS的定性定量分析方法，为菌菇类复杂基质样品提供可靠的农残检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

456-TQ气相色谱串联质谱仪（美国布鲁克公司）;JM-B3002型百分之一电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）;N-EVAP型氮吹仪（美国Organomation公司）;UNIVERSAL 320型离心机（德国海蒂诗公司）;Multi Reax型多功能振荡器（德国海道夫公司）;CH-300型超声波（北京创新德超声电子研究所）。乙腈、丙酮均为色谱纯（德国Merck公司）;氯化钠为分析纯（天津科密欧有限公司）;无水硫酸镁（Agilent公司）、C18 Endcapped（Agilent公司）;0.22 μm尼龙针孔滤膜（津腾公司）;

25种有机磷农药标准品1 000 μg·mL-1均购自农业农村部环境保护科研监测所（天津）。用丙酮分别稀释成80 μg·mL-1的储备液，再稀释成3组4 μg·mL-1的混合标准溶液于-18 ℃储存，使用前用空白香菇基质溶液配制成所需浓度的25种农药混合标准工作液。

1.2 样品的制备

香菇样品于2017年5月购自郑州市农贸市场。取香菇整株，经四分法缩分后，用料理机绞碎充分混匀成浆状。

1.3 样品前处理

1.3.1 先加盐振荡超声提取法 准确称取（5.00 ± 0.02）g浆状样品于50 mL离心管中，加入3.0 g氯化钠、10.0 mL乙腈，涡旋振荡5 min超声10 min。

1.3.2 振荡超声后加盐提取法 按1.3.1称取样品，加入10.0 mL乙腈，涡旋振荡5 min超声提取10 min后，然后再加入3.0 g氯化钠，涡旋振荡2 min。

1.3.3 净化 样品在5 000 r·min-1条件下离心5 min后，取上清液5.0 mL加入预先称量好的盛有600 mg无水MgSO4和50 mg C18的10 mL离心管中，涡旋混匀5.0 min，离心5 min，再移取上清液2.0 mL于10 mL的玻璃离心管中，60 ℃水浴氮吹至近干，用丙酮准确定容至1.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜待测。

1.4 仪器参数设置

1.4.1 色谱条件 色谱柱：DB-17MS，50%聚苯基甲基硅氧烷柱，30 m×0.25 mm，0.25 μm;进样口温度260 ℃;进样量1 μL;载气氦气;流速1 mL·min-1;升温程序：初始温度110 ℃，保持1.0 min;升温速率20 ℃·min-1，到200 ℃，保持0.0 min;升温速率10 ℃·min-1，到260 ℃，保持2.0 min;升溫速率5 ℃·min-1，到300 ℃，保持5.0 min;共26.5 min。

1.4.2 质谱条件 离子源：EI源，电离电压70 eV;离子源温度：200 ℃;碰撞气：氩气;传输线温度：260 ℃，MRM扫描模式各参数见表1。

表1 25种有机磷类农药监测离子对及保留时间

[编

号 农药名称 保留

时间/

min 定量离子对 定性离子对 碰撞能量/V 定量

离子 定性

离子 1 敌百虫 4.47 185.0>93.0 185.0>63.0 10 15 2 甲胺磷 5.03 141.0>95.0 141.0>79.0 10 15 3 乙酰甲胺磷 6.51 136.0>94.0 136.0>42.0 15 10 4 灭线磷 7.25 158.0>97.0 158.0>81.0 18 15 5 治螟磷 7.57 322.0>146.0 322.0>266.0 10 10 6 甲拌磷 7.75 121.0>65.0 121.0>93.0 5 5 7 氧化乐果 7.99 156.0>110.0 156.0>79.0 10 25 8 特丁硫磷 8.15 231.0>129.0 231.0>97.0 50 50 9 二嗪磷 8.22 137.0>84.0 199.0>93.0 8 10 10 乐果 9.08 125.0>79.0 125.0>47.0 5 10 11 甲基对硫磷 9.93 263.0>109.0 263.0>127.0 10 5 12 毒死蜱 10.17 314.0>258.0 314.0>286.0 15 10 13 马拉硫磷 10.23 173.0>99.0 173.0>127.0 18 10 14 杀螟硫磷 10.32 277.0>109.0 260.0>125.0 10 15 15 对硫磷 10.41 291.0>109.0 291.0>81.0 10 15 16 甲基异柳磷 10.73 199.0>121.0 199.0>93.0 5 20 17 倍硫磷 10.76 278.0>109.0 278.0>125.0 20 18 18 甲拌磷砜 10.94 153.0>97.0 153.0>125.0 10 5 19 水胺硫磷 11.07 136.0>108.0 121.0>93.0 10 5 20 丙溴磷 12.10 139.0>97.0 139.0>121.0 10 10 21 杀扑磷 12.39 145.0>85.0 145.0>58.0 10 15 22 三唑磷 15.03 161.0>134.0 161.0>106.0 5 10 23 伏杀硫磷 17.43 182.0>111.0 182.0>75.0 10 20 24 亚胺硫磷 17.68 160.0>133.0 160.0>77.0 10 25 25 蝇毒磷 19.95 362.0>109.0 362.0>226.0 15 15 ]

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

用丙酮作溶剂，分别配制25种有机磷农药单一标准溶液进行MRM参数优化。对各个待测目标物的标准溶液进行母离子扫描，扫描范围一般为50～500。获得合适的母离子后再进行二级碎片扫描并优化碰撞能量，获得响应值较好的两个离子对，得出最优MRM扫描质谱条件。优化后各化合物母离子、子离子、碰撞能量参数见表1。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 2种提取方式的回收率比较 采用2种提取方法，分别对香菇加标样品（0.08 mg·kg-1，n=5）进行提取，经1.3.3步净化后测定结果见图1。1.3.1法25种有机磷农药的回收率为49%～91%，相对标准偏差为5.3%～14.8%，1.3.2法回收率为70%～103%，相对标准偏差为2.9%～13.2%。1.3.1法与1.3.2法相比，敌百虫、甲胺磷等19种化合物回收率较低在49%～68%之间，氧化乐果、甲基对硫磷等6种化合物的回收率在72%～91%之间。可能是先加盐振荡超声的提取方法不能使含盐样品与乙腈充分混合，降低了乙腈的提取效率。

2.2.2 色谱峰干扰 考察2种提取方法得到的空白香菇基質配制的25种有机磷农药（0.08 mg·kg-1）混合标准品MRM色谱图。发现经1.3.2振荡超声后加盐提取法提取得到色谱图，24种化合物都获得了较好的分离结果，而甲基对硫磷受基质干扰与杂质峰明显重叠，如图2-a所示。采用1.3.1先加盐振荡超声提取法提取，该基质干扰峰响应明显降低如图2-b所示。从图中可以看到，保留时间9.901 min处基质中未知峰基本消失，保留时间9.932 min处甲基对硫磷色谱峰峰形对称无干扰。该方法甲基对硫磷回收率为77%，相对标准偏差为8.8%。说明采用先加盐振荡超声提取法提取，保留时间9.901 min处未知峰提取效率较差，而甲基对硫磷能获得较满意的提取效率。

2.3 C18的净化效果

C18是固相萃取中的常用试剂，可去除样品中非极性干扰物，适用于果蔬中农残检测的净化。根据QuEChERS方法中C18的常用量，分别选择0、50、200、400 mg按1.3.3步骤进行净化处理，考察C18的净化效果。

向0.08 mg·kg-1加标水平下的香菇提取液中分别加入0、50、200、400 mg C18，每组5个平行样品，每个样品上机采集15针，每组共计75针。用对应C18量净化后的空白香菇基质溶液配制的标准品单点定量，结果发现50～400 mg的C18都可以保证连续多针样品检测结果的重复性及稳定性，且3组样品25种有机磷回收率平均值都在75%～108%之间，相对标准偏差均<8.3%。但不加C18净化试剂，连续采集30针左右，样品的重复性变差，因此本文采用50 mg C18作为其净化试剂的用量。保证了连续进样的稳定性，避免了仪器的频繁维护，降低了检测成本，也可满足检测要求。

2.4 基质效应

GC-MS/MS法检测农药残留时，样品基质成分会转移到进样口、毛细管柱头等活性位点产生富集，最大限度地减少了目标物的吸附和分解从而产生较高的分析信号，导致农药回收率通常会>100%，出现基质诱导增强效应。但另一方面GC-MS/MS进样口、离子源易污染，污染后会引起色谱峰展宽、响应下降、重现性变差，甚至保留时间发生偏移。所以需综合考虑基质效应带来的影响。

笔者通过测定目标物在丙酮溶剂中的响应值（A，n=3），及在空白香菇基质溶液中的响应值（B，n=3），分析0.08 μg·mL-1浓度下，C18净化后的香菇基质溶液中25种有机磷的基质效应ME/%=（B/A-1）×100。乙酰甲胺磷、亚胺硫磷2种ME>250，甲胺磷、氧乐果、乐果、杀扑磷、三唑磷、伏杀硫磷、蝇毒磷7种ME>100，其余16种ME在0～100%之间，说明香菇基质溶液中25种有机磷均具有明显的基质增强效应，且基质效应差异显著，这同陈晓水等[17]报道的QuEChERS前处理-GC-MS/MS检测分析烟草样品中有机磷类农药的基质效应相符。

2.5 方法定量限、添加回收率、精密度及线性关系

在空白香菇试样中分别添加浓度为0.01、0.08、0.32 mg·kg-1的25种有机磷农药进行回收率试验，每个添加水平5个平行样，依步骤1.3.2（甲基对硫磷用方法1.3.1）、1.3.3、1.4方法进行检测，基质标准溶液-外标法定量。结果见表2，25种有机磷的回收率为70.7%～116.6%，相对标准变差为4.4%～14.0%。以信噪比（S/N）≥10的添加浓度确定方法定量限（LOQ），都满足欧盟栽培菌中有机磷农药最低限量（0.01 mg·kg-1）的要求。

依步骤1.3.2（甲基对硫磷用方法1.3.1），1.3.3对空白香菇样品进行处理，用得到的样品基质溶液配制成6个质量浓度为0.002、0.005、0.02、0.08、0.20、0.40 μg·mL-1的25种有机磷农药基质混合标准溶液。采用1.4的仪器参数进行分析，以峰面积y对质量浓度x做回归方程y=kx+b。敌百虫、灭线磷、对硫磷、杀扑磷等16种农药在0.002～0.4 μg·mL-1范围内线性关系良好，甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果、水胺硫磷等9种农药在0.005～0.4μg·mL-1范围内线性关系良好。25种农药相关系数都在0.992 3～0.998 7之间。

3 讨论与结论

香菇含有大量的多糖、嘌呤、核酸及含硫香味物质等，其成分复杂，不同的提取、净化方式得到的样液基质也不尽相同。单美娜[4]等采用乙腈超声提取，氯化钠盐析分层，CleanertPC /NH2固相萃取柱净化，结合PFPD检测器检测，建立了食用菌中22种有机磷类农残检测的固相萃取气相色谱法。笔者对其提取方法进行了优化，简化了称样量、提取试剂用量、超声时间等条件，增加了涡旋振荡的步骤使提取更充分。张爱芝[9]等在《QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中250种农药残留》文中考察了C18的净化效果，提到C18的加入可使空白样品的基线噪声明显降低，这与笔者在本试验中对C18净化效果的描述基本一致。

从本试验结果可以看出，采用乙腈、氯化钠振荡超声提取，C18分散固相萃取的前处理方法，结合GC-MS/MS分析技术，香菇基质溶液匹配标准品-外标法定量，可完成25种有机磷农药的定性、定量分析。试验发现提取过程中氯化钠加入的先后顺序可影响其提取效率，设计2种提取方案，对回收率、色谱峰干扰的数据进行比对分析。1.3.1先加盐振荡超声提取法提取效率较低，敌百虫、甲胺磷等19种化合物回收率在49%～68%之间，仅氧化乐果、甲基对硫磷等6种化合物的回收率在72%～91%之间可满足一般农残检测回收率在70%～120%之间的要求。该提取方法甲基对硫磷处无明显杂峰干扰，不影响其准确定性、定量。1.3.2振荡超声后加盐提取法得到的色谱图，24种化合物均得到良好的分离效果，且回收率在70%～103%之间满足检测要求，仅甲基对硫磷处有杂峰干扰，影响其准确定性、定量。因此，本文鲜香菇样品中的有机磷农残检测，敌百虫等24种化合物均采用1.3.2振荡超声后加盐提取法进行提取，甲基对硫磷采用1.3.1先加盐振荡超声提取法提取。

该方法简单、快速，能够保证批量样品连续检测的稳定性、准确性，为香菇这种复杂基质样品中有机磷类农药的检测提供可靠的技术手段，可用于日常香菇生产种植及市场流通中有机磷类农药残留的普查监测。

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