宁夏回族自治区嫁接西瓜发生黄瓜绿斑驳花叶病毒病

刘美　解昆仑　刘茜　古勤生

摘    要： 黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是我国重要的检疫性病毒。2018年宁夏回族自治区中卫市种植的西瓜部分发生了严重倒瓤，通过实地调研，对发病西瓜植株的叶片和果实症状进行现场观察，初步怀疑为CGMMV侵染所致。对采集的3份西瓜病样采用ELISA（Enzyme Linked Immuno-Sorbnent Assay）和RT-PCR（Reverse Transcription PCR）检测，以及克隆的外壳蛋白基因（CP）序列分析，结果表明，3份样品均感染了CGMMV，证实宁夏回族自治区西瓜发生倒瓤是由CGMMV引起，这也是首次发现CGMMV在宁夏发生。

关键词： 西瓜; 宁夏; 黄瓜绿斑驳花叶病毒

Occurence of Cucumber green mottle mosaic virus in grafted watermelon in Ningxia Hui Autonomous Region of China

LIU Mei，XIE Kunlun， LIU Xi， GU Qinsheng

（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，Henan，China）

Abstract： Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） is an important quarantine virus in China. In 2018， the watermelon plants in Ningxia Hui autonomous region was seriously infected. Through field investigation， it was initially suspected to be caused by the infection of the virus by the observation of the symptoms of watermelon leaves and fruits. For the detection of the virus， ELISA （Enzym Linked Immuno-Sorbent Assay） and RT-PCR （Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） detection and sequence analysis were performed on three watermelon samples. The results showed that all the three samples were infected with CGMMV， which confirmed that watermelon fruit blood flesh in Ningxia Hui autonomous region was caused by CGMMV. The virus was first reported in Ningxia.

Key words： Watermelon;Ningxia;Cucumber green mottle mosaic virus

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）于1935年在英国感病黄瓜上首次发现并报道[1]，该病毒在自然条件下主要侵染黄瓜、西瓜、甜瓜和瓠瓜等多种葫芦科作物[2]，通过种子、水、土壤和机械摩擦等多种方式传播，病害蔓延扩散迅速[3]。目前已在40多个国家或地区内报道发生[4]。2007年有报道称，2005年CGMMV在我国辽宁省盖州市侵染西瓜面积达333 hm2，绝收的约13 hm2，已在我国部分地区造成西瓜毁灭性死亡[5]。被该病毒侵染发病后的西瓜表现为叶缘出现不规则斑驳，绿色突起或泡状，近叶脉部分正常，叶片老化后则症状不明显;部分叶片有时出现黄色斑点，果柄上有褐色的坏死斑，是该病毒侵染西瓜果实的主要特征;果实表面具有浓绿色近圆形斑纹，果肉接近果皮部分呈黄色水渍状，然后内部西瓜种子周边果肉变为紫红色或暗红色水渍状;内部含有大量块状黄色纤维，逐步形成空洞类似于丝瓜瓤状，成熟果肉全部变为暗红色，味苦不能食用，被称为“血瓤”或“倒瓤” [6]。

自2004年厦门出入境检疫局从日本进口的南瓜种子中检测到CGMMV，此后在北京、海南和辽宁等地区发生了危害，农业部在2006年发布公告将其确定为我国重要的检疫性病毒[7-9]。监测该病毒病害的发生、建立种子健康检测、应用健康种子是保护产业免受该病毒侵染和危害最根本的措施[10]。

宁夏回族自治区西瓜年播种面积70万hm2以上，过去采用自根苗栽培，由于连作病害不断加重，近几年开始推广嫁接栽培。而西瓜嫁接所利用的砧木葫蘆、南瓜和接穗西瓜易携带CGMMV，嫁接西瓜容易通过带毒的砧木或接穗种子感染该病毒，因此，我国嫁接西瓜生产主要省份和地区均有该病害发生与分布[11]，对我国西瓜产业构成重要威胁。随着宁夏回族自治区嫁接栽培的应用与推广，黄瓜绿斑驳花叶病毒在该地区传入与蔓延的风险也加大。

2018年监测发现该地区发生了CGMMV，本文系该病毒在宁夏回族自治区发生的首次报道。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年7月27日在宁夏中卫嫁接西瓜病毒病发生地选取3株症状明显的西瓜植株，每株采病叶1份，分别标记为NX1、NX2和NX3，用保鲜袋分别装好带回河南省果树瓜类生物学重点实验室。菌种与载体：大肠杆菌感受态细胞TOP10购买于北京博迈德公司，克隆载体PTOPO-Blunt购自艾德莱生物。

1.2 田间病害癥状观察

分别记载拍摄植株整体、叶片和西瓜果实的剖面。

1.3 检测

采用ELISA和One Step RT-PCR方法。ELISA检测：CGMMV检测抗体购自北京艾康健动物疫苗技术有限公司，按照说明书进行实验操作。One Step RT-PCR检测：首先根据GenBank数据库已有的CGMMV序列设计扩增部分运动蛋白基因（MP）与整个外壳蛋白基因（CP）的特异性引物，5420F：5-TCCTTTGACTTTAGAGGTCG-3和3UTR：5-TGGGCCCCTACCCGGGGAA-3。对发病样品（NX1、NX2和NX3）和健康植株进行总RNA提取，之后以RNA为模板，参照TAKARA的One Step RT-PCR说明书进行PCR检测。其中，CGMMV检测所用引物为5420F/3UTR，其PCR体系为：2×One Step Buffer（Dye Plus） 10 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 0.8 μL，5420F（10 μmol·L-1） 1 μL，3UTR（10 μmol·L-1） 1 μL，RNA 1 μL，RNase Free H2O 6.2 μL，总体积为 20 μL。PCR程序为：50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s;57 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min，35个循环后72 ℃延伸5 min，16 ℃保存;PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 CP基因克隆与序列分析

CP基因克隆：利用反转录试剂盒（TAKARA）对3份样品的总RNA（1μg）进行随机引物反转录，对反转录获得的第1条链CDNA用5420F/3UTR进行扩增，扩增片段长度为1 004 bp，利用胶回收试剂盒（Axygen）回收目的片段并与其克隆载体PTOPO-Blunt载体进行连接转化，挑选阳性克隆经PCR初步鉴定后送样测序。

序列分析：对试验中获得的3份CGMMV宁夏分离物包含CP基因片段的序列，用Clustalx 1.83软件进行多序列比对分析;宁夏3份样品与GenBank中已公布的CGMMV基因组序列用BLAST在线软件进行序列比对。运用MEGA 7.0.26软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ），选择重复次数为1 000，以同属的麻花叶病毒（Sunn-hemp mosaic virus，SHMV）的CP基因序列为外群构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 症状

发病西瓜植株出现全株性系统性叶片病变，叶片表现斑驳，沿叶片边缘表现褪绿，部分出现黄化，叶片对光观察更为明显;果实切开出现倒瓤，种子周围形成晕圈，果柄处产生褐色坏死斑（图1）。

2.2 黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定

用CGMMV的抗体做DAS-ELISA检测，结果均为阳性（图2）;用CGMMV的特异性引物进行one step RT-PCR检测，可扩增获得预期目的片段，大小为1 004 bp（图3）。

2.3 CGMMV CP 基因序列分析

宁夏3份样品分离物间CP 核苷酸序列相似性为100%;与已报道的序列比对，其CP核苷酸序列相似性为93%～99%，最多仅有8个碱基位点发生改变。选择数据库中来自不同国家和地区16条CGMMV分离物的CP基因序列与本研究中获得的宁夏分离物中CP基因的序列构建系统发生树（表1，图4），由此可确定宁夏分离物为黄瓜绿斑驳花叶病毒病原，而且CP基因的核苷酸序列不存在分子多样性。

3 讨 论

宁夏回族自治区的西瓜产业是我国西瓜产业的重要组成部分，不仅栽培面积较大和集中，更以中卫市的压砂栽培方式而创造了奇迹，所生产的西瓜品质优良，供应时间多集中在7月中下旬至8月，极大地弥补了该时间段华东地区西瓜供应不足的局面，因而形成了宁夏西瓜产业的特色。

为解决重茬导致的种植地区病害加重的问题，宁夏地区几年来开始推广嫁接栽培方式，而目前的检测表明，在西瓜嫁接的地区，黄瓜绿斑驳花叶病毒更易发生大暴发[11]。笔者首先对宁夏中卫种植西瓜病害暴发地区进行实地调研，通过对发病植株的整体、叶片以及果实剖面的观察，初步鉴定出该地区病害大暴发是由CGMMV引起的，采集该地区发病瓜地的3份嫁接西瓜样本，对其进行ELISA检测和一步法RT-PCR验证，结果表明，2018年宁夏中卫地区西瓜病毒病大暴发确由CGMMV引起。为了进一步确定宁夏CGMMV的分类地位，笔者克隆了3份采集样本分离物的CP基因，3个宁夏分离物的CP基因之间核苷酸序列一致性达到100%，与GenBank数据库中已报道的大多数CGMMV分离物的核苷酸序列一致性高达99%，与俄罗斯的分离物的一致性最低，达93%，推测可能是由于地理来源不同导致的。通过系统进化树可以明确看到宁夏分离物（NX1）与安徽、河南、浙江和山东的分离物同源性最为相近，可能因为CGMMV是通过种质交流与远距离调运，或者是通过带毒的西瓜嫁接砧木传播到宁夏中卫地区，由此体现了加强从原种到繁育种子的检疫的重要性[12]。

为了保障产业的持续健康发展，监测种传病害尤其是瓜类细菌性果斑病（BFB）和CGMMV是最为重要的措施。通过对宁夏中卫嫁接西瓜产区的CGMMV进行实地调研、取样分析，已经证明田间倒瓤西瓜发生CGMMV，发生该病害的嫁接西瓜约200 hm2，系该地区关于CGMMV发生的首次报道。CGMMV是一种致病性强、传播途径广并且防治极其困难的病毒，目前，选择和种植抗病品种是防治CGMMV的有效途径。其次，种植前应结合该病毒的传播方式从源头预防其发生，应选用健康的或者经过严格消毒的种子或种苗，以及严格育苗管理的嫁接苗;采用轮作、及时清除田间病残体和用熟石灰处理病田的方式来预防土壤传播;为避免接触传播，在嫁接、修剪杈芽等栽培管理阶段应对手部和操作工具进行消毒处理[11]。

一旦发生CGMMV，该地区就必须建立防御该病毒的系统工程：（1）集中处理病株、病瓜，晾干焚烧，减少对土壤的污染;（2）对全区生产采用的西瓜种子和砧木种子必须抽样检测，发现可能的风险源，应该采用不带毒的种子;（3）加强育苗的消毒处理;（4）生产区的全面监测，一旦发现及早处理[5]。如何建立该系统工程，需要政府、企业、科研、农户等不同层面的参与、组织、协调、管理、执行、监测、处理等，方方面面配合才能够完成。

致谢：感谢浙江大学宋凤鸣教授、北京市农林科学院蔬菜研究中心张超副研究员、宁夏回族自治区中卫市沙坡头区农业技术推广服务中心丁吉文研究员等一同田间调查！

参考文献

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[2] OKADA Y.Cucumber green mottle mosaic virus[M]//The plant viruses.Springer，Boston，MA，1986：267-281.

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