海洋酸化影响重金属Cd对石莼的生理学毒性

江莹莹， 金 鹏， 曾晓鹏， 卫燕云， 夏建荣

(广州大学 环境科学与工程学院， 广东 广州 510006)

工业革命开始以来，全球大气CO2浓度一直处于上升之中，据预测，到21世纪末 pCO2将达到 1 000×10-6[1].大气 CO2浓度升高，使 CO2在海水中溶解量增加，海水 pH 下降，导致海洋酸化，到 2100 年 pH 值将降低 0.3～0.4[2].大型海藻作为海洋重要的初级生产力，和高等植物一样，利用核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶(Rubisco)催化固定 CO2.面对大气中 CO2浓度的升高，藻类对此的响应具有种类差异性和特异性，这可能与它们的无机碳利用机制有关.例如，大气CO2浓度的升高有利于马尾藻(Sargassummuticum)[3]和浒苔(Ulvaprolifera)[4]的生长；而硬石莼(Ulvarigida)的生长和光合作用则不受影响[5]；也有研究表明，CO2浓度的升高降低了江蓠(Gracilariatenuistipitata)的光合速率和色素含量[6]，抑制了黑藻(Eckloniastolonifera)的生长[7].

海洋重金属污染也日益严重，在部分重金属污染的区域，如镉污染区域，Cd2+浓度可达到 16 mg/L[8].海洋镉污染的出现已经对海洋藻类构成严重威胁[9-11].镉对藻类的毒性作用机制主要涉及其与含羟基、氨基、巯基的蛋白质分子结合，影响酶的功能，导致生长受到抑制[12].同时镉与锌蛋白酶会发生亲合反应，置换出锌，干扰碳酸酐酶的活性和生理功能，从而可能影响无机碳的获取[13-14].在大型藻类的研究中，CO2浓度升高情况下，pH降低会增加金属的溶解度，可能导致沉积物和有机配体中金属的解吸，增加海水中重金属离子的含量[15-16]，从而影响重金属的毒性，如高浓度 CO2(1 400×10-6)加剧了 Cu 对浒苔的毒性[17]，但海洋酸化又能够缓解 Cd2+对坛紫菜(Pyropiahaitanensis)的毒性[18]，可见海洋酸化导致重金属毒性变化在不同海藻中存在明显差异.石莼是我国沿海常见的大型海藻，具有分布广、生长快等特点，但在面临重金属镉污染和海洋酸化的环境时，它们如何响应还鲜有报道.本研究利用石莼作为实验材料，通过在不同 CO2浓度(390×10-6和 1 000×10-6)和 Cd2+浓度(0 mmol/L、0.05 mmol/L和 0.1 mmol/L)下培养，测定相对生长速率、净光合速率、暗呼吸速率、色素含量、叶绿素荧光参数以及胞外碳酸酐酶活性等指标，评估 CO2浓度升高和不同 Cd2+水平对石莼的生理学影响，为预测大气 CO2浓度升高导致的海洋酸化可能对重金属毒性的影响提供理论基础.

1 实验方法

1.1 实验设置

经过 4 d暂养后，将生长状态良好的石莼剪成质量约为 0.1 g(Fw)的矩形叶片置于 2 L 聚碳酸酯(PC)瓶中.PC 瓶中 f/2 加富的人工海水预先分别通过 CO2加富器(CE100D，武汉瑞华仪器设备有限责任公司，中国)通入 390×10-6和 1 000×10-6CO2空气 24 h，使其 pH 分别稳定在约8.20±0.05和7.80±0.05.实验设置两组 CO2浓度，分别通入正常空气 390×10-6(Air)和含 1 000×10-6CO2空气(+CO2)，通气速率保持在 0.4 L/min.三个 Cd2+浓度梯度分别为 0 mmol/L(对照组， Control)、0.05 mmol/L(中等镉浓度，MCd)和 0.10 mmol/L(高镉浓度，HCd).温度和光强控制条件与暂养相同，每个培养条件设置三个平行样.培养期间每 48 h 更换一次人工海水，持续通入 390×10-6和 1 000×10-6CO2空气以维持 pH，培养 7 d后用于以下实验.

1.2 相对生长速率

将石莼从培养介质中捞出，用吸水纸吸干表面附着水分后，测定鲜重(Fw)，石莼的相对生长速率用以下公式计算(Relative Growth Rate，RGR)[19]：

(1)

式中：Wt为第t天所称的藻体鲜重，g；W0为藻体初始鲜重，g.

1.3 光合放氧和暗呼吸速率

取 5 mL 培养液于 20 ℃ 恒温反应槽内，加入约 0.006 g 的藻片，通过磁力搅拌器在反应槽内匀速搅动，分别在光强为 400 μmol photons/(m·s)和在黑暗条件下，通过液相氧电极(YSI Model 5 300，Yellow Springs Instrument Co.，美国) 测定藻体的光合放氧速率(Net photosynthetic rate，Pn)和暗呼吸速率(Dark respiration rate，Rd).

1.4 叶绿素荧光

叶绿素 a 荧光参数是通过使用便携式调制叶绿素荧光仪(PAM-2100， Heinz Walz GmbH，德国)测定.弱测量光和光化光分别为 0.01 和 100 μmol photons/(m·s)，饱和脉冲光为 5 000 μmol photons/(m·s)，持续 0.8 s.PSII 的最大光能转化效率(Fv/Fm)、实际光能转化效率(Yield)[20-21]通过以下公式计算：

(2)

其中,Fv为暗适应可变荧光值，Fm为暗适应饱和光强下的最大荧光值，F0为暗适应出示荧光值.

(3)

F′m为光化光的最大荧光产量稳定水平,F为激发状态下的实时荧光.

1.5 色素含量

将藻体置于含 10 mL 90% 丙酮的研钵中研磨后，在 4 ℃ 黑暗环境下提取 24 h，离心 10 min，吸取上清液用紫外可见分光光度计(UV-1 800，岛津，日本) 测定波长分别为 750 nm、665 nm、652 nm、510 nm 和 480 nm 的吸光度，色素含量计算参考Porra[22]和Parsons等[23]的方法：

Chla=12.25×(A665-A750)-2.55×(A652-A750)

(4)

Chlb=20.31×(A652-A750)-4.91×(A665-A750)

(5)

Car=7.6×[(A480-A750)-1.49×(A510-A750)

(6)

1.6 胞外碳酸酐酶活性

胞外碳酸酐酶活性(extracellular Carbonic Anhydrase，eCA)采用 Wilbur等[24]的方法测定.将藻体放入含有巴比妥-盐酸缓冲溶液 (20 mM，pH 8.3)的反应槽中，磁力搅拌器搅动，加入饱和 CO2水(将纯水置于 4 ℃ 恒温循环水浴中，通入高纯度的 CO2气体约 60 min 制得)，记录 pH 值从 8.3 降低到 7.3 的时间.酶的单位计算公式为

(7)

其中，t0和t分别代表不加藻和加藻的反应时间.

1.7 数据分析

数据以平均值±标准差表示，使用 Excel 和 Origin8.5.1 软件(Origin Lab Corp.，Northampton，MA，USA)进行数据整理和分析.运用双因素方差分析(Two-way ANOVA 和 Fisher LSD) 分析数据间的差异性.以P<0.05 作为显著差异水平.

2 实验结果

2.1 相对生长速率

图1(a)表示不同CO2浓度及Cd2+浓度培养下石莼的相对生长速率.在大气CO2浓度下，随着 Cd2+浓度升高，相对生长速率出现下降趋势.由对照组到中等镉浓度(MCd)水平时，相对生长速率降低 32.78%(P<0.05)，到高镉浓度(HCd) 水平时，与 MCd 相比，下降幅度则不明显(P>0.05).HCd 培养下相对生长速率最低，约为 11.57±3.91%/d.高 CO2浓度下，随着 Cd2+浓度逐渐升高，相对生长速率分别下降 50.11% (P<0.05，RGR=11.64±3.01 %/d)和 61.77%(P<0.05,RGR=4.45±0.17 %/d).双因素方差分析表明，CO2浓度升高对生长没有显著影响，镉浓度升高则显著降低石莼的相对生长速率(Two-way ANOVA, CO2浓度：P>0.05， 镉浓度：P<0.05)，且二者交互效应显著(Two-way ANOVA,P<0.05)，表明 CO2浓度升高增加了 Cd2+对石莼生长的毒性作用，见图1(b).

图1 不同 CO2和 Cd2+浓度条件下石莼的相对生长速率(a)以及不同CO2条件下 Cd2+浓度对石莼相对生长速率的抑制率(b)

Fig.1 Relative growth rate (a) and the inhibition rate (b) ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同Cd2+浓度下，不同 CO2浓度对石莼产生显著影响(P<0.05)；不同横线高度表示相同 CO2浓度下，不同 Cd2+浓度对石莼产生显著影响(P<0.05).

2.2 净光合速率

如图 2(a) 所示，CO2浓度升高与 Cd2+浓度升高均可显著降低石莼的净光合速率(Two-way ANOVA，CO2浓度：P<0.05，Cd2+浓度：P<0.05).在正常CO2浓度条件下，与对照组(Control)相比，HCd 条件下，石莼净光合速率降低了 70.86%(P<0.05，Pn=14.33±1.46 O2/(g FW·h))；在高 CO2浓度条件下,则降低了 89.59%(P<0.05，Pn=3.57±0.31 O2/(g FW·h)).如图2(b)所示,与相对生长速率类似，CO2浓度升高与 Cd2+浓度升高对石莼的净光合作用亦存在显著的交互效应(Two-way ANOVA，P<0.05)，即 CO2浓度升高增加了 Cd2+对石莼净光合作用的毒性作用.

2.3 胞外碳酸酐酶活性

不同CO2浓度及Cd2+浓度培养下石莼胞外碳酸酐酶的活性变化如图 3 所示， 在两种 CO2浓度下，Cd2+浓度升高均显著降低胞外碳酸酐酶活性.如与对照组比，在正常 CO2浓度条件下，HCd 中胞外碳酸酐酶活性降低了 65.11%(P<0.05，eCA=7.17±0.96 EU/mg SP)；在高 CO2浓度条件下，HCd 中胞外碳酸酐酶活性则降低了 79.09%(P<0.05，eCA=2.09±0.75 EU/mg SP).双因素方差分析表明，CO2浓度升高与 Cd2+浓度升高均显著降低石莼的胞外碳酸酐酶活性(Two-way ANOVA，CO2浓度：P<0.05，Cd2+浓度：P<0.05)，且二者交互效应显著(Two-way ANOVA，P<0.05)，表明 CO2浓度升高增加了 Cd2+对石莼胞外碳酸酐酶活性的抑制作用.

图2 不同 CO2和 Cd2+浓度条件下石莼的净光合速率(a)以及不同 CO2条件下 Cd2+浓度对石莼净光合速率的抑制率(b)

Fig.2 Net photosynthetic rate (a) and the inhibition rate (b) ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同 Cd2+浓度下，不同 CO2浓度对石莼产生显著影响(P<0.05)；不同横线高度表示相同 CO2浓度下，不同 Cd2+浓度对石莼产生显著影响(P<0.05).

图3 不同 CO2和 Cd2+浓度条件下石莼的胞外碳酸酐酶活性

Fig.3 Extracellular carbon anhydrase activity ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同 Cd2+浓度下，不同 CO2浓度对石莼产生显著影响(P<0.05)；不同横线高度表示相同 CO2浓度下，不同 Cd2+浓度对石莼产生显著影响(P<0.05).

2.4 暗呼吸速率

与相对生长速率、胞外碳酸酐酶活性及净光合速率响应截然相反，在正常 CO2浓度条件下，与对照组(Control)相比，HCd 条件下，石莼净暗呼吸速率升高 68.49%(P<0.05，Rd=14.98±4.21 O2/(g FW·h))； 在高 CO2浓度条件下，则升高了212.01%(P<0.05，Rd=23.91±2.75 O2/(g FW·h))(图 4).CO2浓度升高与Cd2+浓度升高对石莼的暗呼吸速率亦存在显著的交互效应(Two-way ANOVA,P<0.05)，即在高 CO2浓度条件下，石莼暗呼吸对 Cd2+更加敏感.

图4 不同 CO2和 Cd2+浓度条件下石莼的暗呼吸速率

Fig.4 Dark respiration rate ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同Cd2+浓度下，不同 CO2浓度对石莼产生显著影响(P<0.05)；不同横线高度表示相同 CO2浓度下，不同 Cd2+浓度对石莼产生显著影响(P<0.05).

2.5 色素含量

如表 1 所示，CO2浓度升高与 Cd2+浓度升高均显著降低石莼的 Chla和 Chlb含量(Two-way ANOVA，CO2浓度：P<0.05，Cd2+浓度：P<0.05).在正常 CO2浓度条件下，与对照组(Control)相比，HCd 条件下，石莼 Chla含量降低了 47.75%(P<0.05)，Chlb含量降低了 35.00%(P<0.05)；在高 CO2浓度条件下，Chla则降低了 60.61%(P<0.05)，Chlb降低 62.86%(P<0.05).CO2浓度升高与 Cd2+浓度升高对石莼的 Chla和 Chlb含量均存在显著的交互效应(Two-way ANOVA，P<0.05).

表1 不同 CO2和 Cd2+浓度条件下石莼的色素含量(mg/g FW)和叶绿素荧光参数

Table 1 Pigment contents (mg/g FW) and chlorophyll fluorescence parameters ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

培养条件Chla/(mg/g FW)Chlb/(mg/g FW)Car/(mg/g FW)Fv/Fm实际光化学效率Air Control0.77±0.06Aa0.40±0.03Aa0.38±0.02Aa0.78±0.01Aa0.50±0.05AaAir MCd0.55±0.05Ba0.30±0.03ABa0.29±0.02Ba0.69±0.02Ba0.38±0.02BaAir HCd0.41±0.10Ca0.26±0.07Ba0.18±0.06Ca0.64±0.01Ca0.28±0.01Ca+CO2 Control0.66±0.08Ab0.39±0.04Aa0.35±0.06Aa0.75±0.01Aa0.49±0.01Aa+CO2 MCd0.42±0.06Bb0.25±0.06Ba0.23±0.04Ba0.63±0.03Bb0.32±0.01Bb+CO2 HCd0.26±0.01Cb0.14±0.01Cb0.15±0.01Ca0.59±0.01Cb0.24±0.02Cb

注：不同小写字母表示相同 Cd2+浓度下，不同 CO2浓度对石莼产生显著影响(P<0.05)；不同大写字母表示相同 CO2浓度下，不同 Cd2+浓度对石莼产生显著影响(P<0.05).

Car 含量在正常 CO2浓度条件下，与对照组(Control)相比，HCd 条件下， 石莼 Car 含量降低了 52.63%(P<0.05)；在高 CO2浓度条件下，Car 则降低了57.14%(P<0.05)(表 1).CO2浓度升高对 Car 含量没有显著影响，Cd2+浓度升高均显著降低石莼的 Car 含量(Two-way ANOVA, CO2浓度：P>0.05，Cd2+浓度：P<0.05).

2.6 叶绿素荧光参数

如表 1 所示，CO2浓度升高与 Cd2+浓度升高均显著降低石莼的Fv/Fm和Yield(Two-way ANOVA，CO2浓度：P<0.05，Cd2+浓度：P<0.05).在正常 CO2浓度条件下，与对照组(Control)相比，HCd 条件下，石莼Fv/Fm含量降低了 17.95%(P<0.05)，Yield含量降低了 44.00%(P<0.05)；在高 CO2浓度条件下，Fv/Fm则降低了 21.33%(P<0.05)，Yield降低 51.02%(P<0.05)(表 1).与 Chla和 Chlb类似，CO2浓度升高与 Cd2+浓度升高对石莼的Fv/Fm和Yield均存在显著的交互效应(Two-way ANOVA，P<0.05).

3 讨 论

3.1 Cd2+ 对石莼的影响

重金属 Cd2+是一种植物非必需元素，当浓度持续升高时，可抑制海藻坛紫菜[18]、龙须菜(Gracilarialemaneiformis)[25]、浒苔和缘管浒苔(UlvaLinza)[26]的生长，但抑制程度与藻种类和所接触的重金属离子浓度密切相关.而在目前的研究中，不管是否处于酸化环境，随着Cd2+浓度的升高，石莼的相对生长速率均明显降低.重金属对植物的毒性由植物的摄取能力和胞内结合位点决定[27].当周围环境中重金属离子达到一定浓度时，细胞壁上的金属结合位点达到饱和，则多余的重金属进入细胞内，参与代谢过程，从而对细胞产生毒性[28].

重金属 Cd2+对藻类色素的影响存在种类差异，如小球藻(Chlorellavulgaris)[29]、浒苔和缘管浒苔[26]Chla和 Chlb含量均明显下降，但对三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)色素含量并没有明显的影响[30].本文的研究结果与前者相似，其原因可能在于 Cd2+抑制了叶绿素合成代谢关键酶氨基乙酰脱氢酶的活性，并最终影响叶绿素合成[31].Car 作为捕光天线色素将吸收的光能传递给叶绿素分子用于光合作用，前人的研究显示，浒苔和缘管浒苔的类胡萝卜素含量由于 Cd2+浓度升高而出现下降的现象[26]，本文的研究结果也证实了 Cd2+影响类胡萝卜素合成.Cd2+在影响石莼色素合成的同时，也导致Fv/Fm、Yield 和光合放氧速率的下降，这与Brembu 等[30]结果相一致.而石莼呼吸速率明显增加，也表明其对重金属解毒的能量需求增加[17]，可见重金属 Cd2+对石莼生长的影响可能是通过抑制色素的合成，下调光能的利用效率，降低光合速率，增加呼吸速率，进而导致有机物积累的降低，生长受到抑制.

3.2 CO2 浓度升高增加了Cd2+对石莼的毒性

在坛紫菜的研究中发现，在高 Cd2+浓度下，高浓度 CO2并没有影响坛紫菜Chla和 Car 含量[18]，而条斑紫菜(Pyropiayezoensis)在高 Zn 浓度下，高浓度CO2导致 Chla含量明显升高[35].目前的研究显示，CO2浓度升高培养下，不同浓度的 Cd2+均能使石莼Chla明显降低，而 Chlb仅在 HCd 条件下降低显著，而 Car 则没有明显变化，表明色素对 CO2和 Cd2+的交互作用影响的敏感度为：Chla>Chlb>Car，这说明石莼处于 Cd2+胁迫环境中，CO2浓度升高可能更容易抑制光能的利用，而对光能的捕获影响较小，这与Fv/Fm和 Yield 的变化也是一致的.光能利用效率的降低，导致光合速率下降.

4 结 论