虫草菌丝对2型糖尿病大鼠认知功能障碍的影响

刘行海 刘红 郑倩 刘华 买文丽

(川北医学院生理学教研室， 四川 南充 637000)

2型糖尿病(T2DM)可累及中枢神经系统，导致认知功能障碍，重者可发展为痴呆〔1，2〕。糖尿病认知功能障碍严重影响患者生活质量。近年来中草药对糖尿病的防治作用受到广泛关注。人工虫草菌丝(CS)是人工发酵培养得到的菌丝。现代药理学证明其对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统及免疫系统有一定作用。本课题组前期工作发现，CS具有能保护胰岛细胞的作用〔3〕。本研究探讨CS对T2DM大鼠认知障碍的影响及其机制。

1 资料与方法

1.1材料 CS(上海雅吉公司，蒸馏水配制：20 mg/ml)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；血糖仪(长沙三诺科技公司)；血清胰岛素检测试剂盒(上海市生物制药研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物公司)；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国GBD公司)；Morris水迷宫计算机图像实时分析系统(成都泰盟有限公司)。

1.2T2DM大鼠模型建立 参照本实验室既往方法〔4〕，12周龄健康雄性清洁级Wistar大鼠50只，体质量(195±16)g。动物合格证号：SYXK(川)2013-076。动物及饲料均由川北医学院实验动物中心提供。自由进食饮水适应性饲养1 w后，随机分出对照组8只，全程采用常规饲料饲养。其余42只采用高能饲料喂养4 w，空腹12 h后一次性腹腔注射STZ 25 mg/kg(STZ临时用0.1 mol/L，pH=4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成1%浓度)。继续高能饲料饲养4 w后，采尾静脉血测定空腹血糖(FBG)、空腹血清胰岛素(FINS)，计算胰岛素敏感指数(ISI)，以FBG>7.8 mmol/L，同时伴有ISI降低作为T2DM模型判断标准〔5〕。34只大鼠复制成功T2DM模型，其余淘汰。

1.3实验动物分组与处理 将成功造模的34只大鼠随机分成模型组10只，CS低剂量(CS1)组8只〔1.5 ml/(kg·d)〕、CS中剂量(CS2)组8只〔3 ml/(kg·d)〕、CS高剂量(CS3)组8只〔6 ml/(kg·d)〕。CS各剂量组每日灌胃给予CS，连续给药4 w。模型组和对照组每日给予等量的生理盐水灌胃。给药期间，全部大鼠常规饲料饲养。

1.4Morris水迷宫测试学习记忆能力 各组给药4 w末进行水迷宫测试7 d(继续给药)。定向航行实验：第 1～5 天，记录2 min内各组逃避潜伏期(从入水到爬上对角线象限的平台所需时间)。空间探索实验：第6天开始，撤去平台，任选一入水点，记录2 min内大鼠在目标象限停留时间。

1.5标本采集及指标测定 Morris水迷宫测试完毕后，大鼠空腹12 h，然后从心脏穿刺采血制备血浆和血清标本并于-80℃保存待测，断髓处死,取脑组织冻存待检。按照试剂盒说明书检测FBG、FINS水平及海马组织SOD活性、MDA、TNF-α含量。

1.6统计学分析 应用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1一般情况 对照组大鼠身体状况良好。模型组具有糖尿病典型症状，反应迟钝，活动减少，毛发紊乱无光泽。随着病程延长,除大鼠体重呈下降趋势外,其他症状和体征更加明显。各CS干预组上述情况均有不同程度改善。模型组死亡3只，CS1组死亡2只， CS2组死亡1只。

2.2各组FBG、FINS和ISI比较 与对照组相比，模型组FBG与FINS水平明显升高，ISI明显降低(P<0.05)。与模型组相比，CS2组和CS3组FBG与FINS水平降低， ISI明显升高 (P<0.05)。CS的作用呈剂量依赖性，见表1。

2.3各组Morris水迷宫实验比较 与对照组比较，模型组逃避潜伏期明显延长，在原平台象限停留的时间明显缩短 (P<0.05)。与模型组比较，CS3组逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)；CS2、CS3组在原平台象限停留的时间明显增加(P<0.05 )，见表2。

2.4各组SOD活性、MDA和TNF-α含量比较 与对照组比较，模型组SOD活性明显降低，MDA、TNF-α含量明显增高(P<0.05)。与模型组比较，CS2组、CS3组SOD活性明显升高，MDA、TNF-α含量明显降低(P<0.05)，见表3。

表1 各组FBG、FINS和ISI比较

与模型组比较：1)P<0.05，下表同

表2 各组Morris水迷宫实验比较

表3 各组SOD活性和MDA、TNF-α含量比较

3 讨 论

目前对T2DM认知功能障碍发病的确切机制尚不明了。已有研究提示，基因调控异常、炎症状态、氧化应激、内质网系统异常、糖基化终末产物积累等多个因素参与了T2DM患者认知功能障碍发生、发展全过程〔6〕。近年来，炎症在T2DM认知功能障碍发病中的作用越来越受到重视。炎症可能作为多种机制的下游关键环节起损害作用〔7〕。Sandireddy等〔8〕报道T2DM患者体内的高血糖可激活多种代谢途径，如多元醇途径、蛋白激酶C途径、晚期糖基化终产物途径和己糖胺途径等，所有这些途径可以直接或间接启动和促进炎症的神经损伤。

海马是学习和记忆的关键区域〔9〕。TNF-α为促炎症细胞因子〔10〕。Jia等〔11〕研究证实，STZ诱导病程5 w的糖尿病大鼠记忆能力明显受损，并伴有海马组织中TNF-α含量升高，这可能证实TNF-α含量与糖尿病大鼠的认知功能障碍密切相关。本实验结果提示，CS对糖尿病大鼠认知功能障碍的改善可能与降低海马TNF-α 含量，抑制炎症反应有关。

氧化应激在糖尿病认知障碍的发生发展过程中发挥重要作用。SOD是体内主要抗氧化酶，保护组织细胞免受氧自由基的损伤；MDA水平反映脂质过氧化程度，其水平升高可提示组织细胞损伤〔12〕。本实验结果表明，T2DM大鼠海马组织中MDA含量增加， SOD活性降低；而CS干预后，明显增强了抗氧化酶活性，减轻了海马组织的损伤。

总之，CS能提高T2DM大鼠学习记忆能力，改善认知功能障碍，其机制可能主要与CS降低T2DM大鼠体内血糖，减轻脑部炎症反应和提高抗氧化能力有关。