β-细辛醚对多房棘球蚴的体外杀伤作用※

郑 佳，李占强，杨全余，廖梦姣，张 颖，胡缤文，汤 锋#，李润乐&

(1.青海大学高原医学研究中心，青海省高原医学应用基础重点实验室，高原医学教育部重点实验室，青海 西宁 810001；2.青海大学医学院，青海 西宁 810001；3.青海省人民医院，青海 西宁 810001；4.遵义第五附属医院，贵州 遵义 536000)

目前治疗包虫病的临床药物主要是阿苯达唑。近年来，我们在中药中发现石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)具有杀伤棘球蚴作用，本研究意图寻找其产生作用的单体化合物。

α-细辛醚和β-细辛醚是石菖蒲根茎中的有效成分[1]。有文献显示菖蒲属金钱蒲的己烷提取物，具有杀虫活性，活性成分为α-细辛醚和β-细辛醚。本研究拟通过体外实验对比α-细辛醚和β细辛醚对多房棘球蚴的杀伤效果，并对不同剂量杀伤效果进行检测，初步明确细辛醚对多房棘球蚴的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青霉素-链霉素混合溶液(Solarbio)，α-细辛醚(成都埃法生物公司，纯度>98%)，β-细辛醚(成都埃法生物公司，纯度>98%)，阿苯达唑(梯希爱公司，纯度>98%)。

BB15型培养箱(Thermo公司)，Axio Vert.A1型光学显微镜(Carl Zeiss Jena公司)。

1.2 方法

1.2.1 α-细辛醚和β-细辛醚药物作用效果检测

多房棘球蚴的分离及体外培养方法详见本课题组前期研究报道[2，3]。α-细辛醚和β-细辛醚分别用DMEM培养基稀释至5 mg/mL，将2 mL药物稀释液分别加入到含有1 000个原头蚴的6孔板中，每组三个复孔。在培养箱中(5% CO2，37℃)培养30 min。将阿苯达唑用DMEM培养基稀释至5 mg/mL，作药物对照。

1.2.2 β细辛醚不同浓度作用效果检测

1.2.3 原头蚴表面结构变化观察

将药物作用后的多房棘球蚴采用扫描电镜样本制备的方法[4]处理后观察其表面结构。

1.2.4 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。结果以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，多重两两比较使用Dunnett-t检验或LSD检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 α-细辛醚和β-细辛醚对多房棘球蚴杀伤作用的药效学评价

将浓度为5 mg/mL的α-细辛醚、β-细辛醚、阿苯达唑在培养基与多房棘球蚴共培养30 min。每孔吸出10 μL用伊红染色，光镜下观察发现5 mg/mL β-细辛醚组内多房棘球蚴被伊红染色，如图1A所示。5 mg/mLβ-细辛醚、阿苯达唑组内多房棘球蚴未被染色，如图1B、C所示。空白对照组多房棘球蚴没有被伊红染色。

2.2 不同剂量β-细辛醚对多房棘球蚴杀伤作用的评价

将浓度分别为5.00、2.50、1.25、0.75 mg/mL的β-细辛醚与多房棘球蚴共培养，分别在0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0 h时吸取10 μL多房棘球蚴溶液，染色发现5 mg/mL和2.5 mg/mL的β-细辛醚分别在0.5 h和2 h时，全部被伊红染色。与浓度为1.25 mg/mL、0.75 mg/mL的β-细辛醚分别作用20 h后，死亡率分别为(98.9±0.4933)%和(64.33±2.333)%，如图2所示。

2.3 对β-细辛醚作用后的多房棘球蚴的表面结构观察

与2.5 mg/mL β-细辛醚作用2 h后的多房棘球蚴立刻用3%戊二醛固定。用扫描电镜进行观察，结果显示空白对照组多房棘球蚴体表完整，原头蚴形态正常，图3白色箭头所示头部微绒毛丰富且整齐，而药物作用后多房棘球蚴体表凹凸不平，头部无微绒毛且形态不完整，钩疑似已脱落。

A：β-细辛醚；B：α-细辛醚；C：阿苯达唑；D：空白对照图1 α-细辛醚和β-细辛醚对多房棘球蚴的杀伤作用图Figure 1 The effect of α-asarone and β-asarone on protoscoleces

A：0.75 mg/mL β-细辛醚作用20 h；B：1.25 mg/mL β-细辛醚作用20 h；

A 空白对照；B β-细辛醚

3 讨论

石菖蒲挥发油中细辛醚类为主要的活性成分，其中α-细辛醚占0.3%、β-细辛醚占0.7%[5]。本研究显示β-细辛醚具有很好杀灭多房棘球蚴的作用。

很多药物的活性与其空间结构有密切的关系，药物的不同立体结构会影响药物活性[6]，在很多药物顺反异构体中只有其中一种具有药物活性，比如乙烯雌酚、维生素A、头孢噻肟钠、亚油酸、花生四烯酸、顺铂等。α-细辛醚和β-细辛醚是顺反异构体，α-细辛醚为(E)-1，2，4-三甲氧基-5-丙烯基苯，β-细辛醚是(Z)-1，2，4-三甲氧基-5-丙烯基苯。本研究发现只有β-细辛醚对多房棘球蚴具有杀伤作用，α-细辛醚随时间推移对多房棘球蚴无任何杀伤作用，因此这两种药物的甲氧基和丙烯基的空间位置结构可能影响了对多房棘球蚴的杀伤作用。一般来说反式结构更为稳定，顺式结构在一定情况会向反式结构转变[7，8]，本文结果中β-细辛醚具有针对多房棘球蚴的杀伤作用，在该药物的应用中应考虑到该药物空间结构不稳定容易发生改变的情况，制剂时应添加稳定剂等。

有研究表明，β-细辛醚可降低癫痫小鼠脑皮质GAD65的表达及Glu、GABA的含量，且呈明显的量效关系，50 mg/kg/d组与基质对照组不具统计学差异[9]。朱彩霞等[10]研究发现β-细辛醚15、30 mg/kg组可显著增加抑郁小鼠脑、纹状体中5-HT、5-HIAA的含量，7.5 mg/kg组差异不显著。因此β-细辛醚的浓度对其药效有影响。本研究在确定β-细辛醚具有杀伤作用后，又进一步对其不同剂量作用时间进行评价，发现β细辛醚在5 mg/mL时可在0.5 h内杀灭所有多房棘球蚴，随浓度的降低完全杀灭的时间变长，显示浓度对多房棘球蚴杀伤效果有影响。

本研究仅说明β-细辛醚在体外对多房棘球蚴具有较好的杀伤作用。但在体内其是否具有相同作用有待进一步确认。