骨髓瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞及淋巴细胞亚群的研究

周 林,王广洲,管 俊,马 莉

(扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院：1.医学检验科；2.血液内科；3.血液学研究所，江苏扬州 225001)

多发性骨髓瘤(MM)是血液系统最常见的恶性肿瘤之一，是一种克隆性浆细胞恶性增殖性疾病。骨髓中异常增生的克隆性浆细胞分泌无免疫功能的单克隆免疫球蛋白(M蛋白)，其常见的临床表现是骨痛、贫血、肾功能不全、感染等[1]。目前，临床已通过调节MM患者机体免疫应答水平，如使用传统化疗药物加免疫调节剂(来那度胺、沙利度胺及各种单克隆抗体药等)的治疗方案，对骨髓瘤患者的预后有很好的效果[2-3]。因此，进一步对MM患者的细胞免疫功能及发病机制进行深入研究并从中找到新的免疫治疗靶点就显得尤为重要。

调节性T细胞(Tregs)是一类具有免疫抑制特性的T淋巴细胞亚群。文献报道，Tregs可抑制机体的抗肿瘤免疫反应，且肿瘤患者肿瘤负荷的增加与CD4+CD25+Tregs细胞的高表达有关[4]。有研究显示，MM患者外周血中T细胞亚群异常是MM患者原发免疫应答缺陷的原因之一[5]。由于MM患者体内存在严重的免疫功能缺陷，因此有必要对其细胞免疫水平进行进一步的研究。

本研究采用流式细胞术对65例MM患者外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞进行检测，研究在MM患者机体中是否异常存在这一类具有免疫抑制特性的T淋巴细胞亚群，探讨其在机体免疫机制中的可能作用。同时通过流式细胞术六色配伍方案进行T、B、NK淋巴细胞亚群的检测，分析其在MM患者中是否存在比例失衡。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月至2014年12月在本院就诊的65例MM患者作为MM组，所有患者均为初诊患者，且所有病例诊断均符合国际诊断标准[6]，且筛选病例时严格排除淋巴瘤、巨球蛋白血症等其他引起免疫功能缺陷的血液系统疾病；其中男39例，女26例，年龄38～82岁，中位年龄56岁。选择20名健康体检人群作为健康对照组，年龄40～75岁，中位年龄54岁，其中男12例，女8例。各组患者性别和年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器及试剂 流式细胞仪为美国BD公司FACS CantoⅡ产品，流式分析软件为BD FACSDiva。低温冰冻离心机为上海科大创新股份有限公司产品。六色淋巴细胞亚群试剂CD3-TITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PE-Cy7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7为美国BD公司产品，单克隆抗体CD4-FITC、CD127-PE和CD25-PC5及阴性对照单抗均购于美国BENCMAN-COULTER公司，溶血素为美国BD公司产品。

1.3方法

1.3.1实验方法 采用流式细胞术对65例MM患者进行CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞的检测，同时使用六色配伍方案检测淋巴细胞亚群分析，对相关数据进行分析，初步研究评估该群细胞的生物学特性及在MM患者疾病发生发展过程中的可能作用机制。

1.3.2CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞及淋巴细胞亚群检测 取2只试管，第1管中加入CD25-PC5、CD4-FITC及CD127-PE各20 μL，另加入抗凝全血100 μL；第2管中加入六色淋巴细胞亚群试剂20 μL，另加入抗凝全血100 μL。两管经轻揉混匀后置于室温下避光反应15 min，加入2 mL溶血素再经室温下避光孵育8 min。待完全溶血后以1 000 r/min离心弃上清，以200 μL灭菌PBS缓冲液重悬细胞，立即进行流式细胞仪检测，并采用BD FACSDiva软件分析数据。淋巴细胞亚群以CD45/SSC设门，计算CD3+百分率以及CD3+CD4+(Th)和CD3+CD8+(Tc)在CD3+细胞中的比率，并计算Th/Tc、CD19+百分率、 CD16+CD56+百分率。检测CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞时，根据前向散射光和侧向散射光以CD4+T细胞设门，每份标本分析10 000个细胞。以CD4+T细胞设门，检测CD4+CD25+CD127low/-细胞在CD4+T细胞中的比率。

2 结 果

2.1MM组与健康对照组外周血中淋巴细胞亚群检测结果 MM组外周血中CD3+CD4+(Th)细胞比例低于健康对照组比例，差异有统计学意义(P<0.01)；MM组外周血中CD3+CD8+(Tc)细胞比例高于健康对照组比例，差异有统计学意义(P<0.01)；MM组外周血中Th/Tc比值低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；MM患者外周血中CD3+(T细胞)和CD19+(B细胞)比例高于健康对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)；MM患者外周血中CD16+CD56+(NK细胞)比例低于健康对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

表1 MM组与对照组淋巴细胞亚群检测结果

图1 MM组和健康对照组中淋巴细胞亚群的流式分析

2.2MM组与对照组外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg的分析 MM组外周血中CD4+CD25+CD127low/-(Treg细胞)比例为(10.82±2.19)%，健康对照组比例为(7.48±1.62)%，MM组高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 MM患者和对照组患者外周血中Treg的流式分析

3 讨 论

MM是一种常见的血液系统恶性肿瘤，研究表明MM患者体内存在免疫系统的多种缺陷，且免疫功能缺陷是该病的一个重要特征并影响疾病进程[7]，但这些免疫缺陷的具体分子机制尚未完全明确。MM是来源于B细胞的恶性浆细胞疾病，但对MM患者免疫功能的研究发现，除了体液免疫功能缺陷，MM患者细胞免疫功能也存在很多异常[8]。本研究结果发现，在MM患者外周血中CD4+Th细胞明显下降及CD8+Tc细胞显著升高，从而导致外周血中具有正常免疫功能的CD4+Th细胞和CD8+T细胞的比值显著降低，从而引起正常T细胞免疫失调。同时，笔者还发现，在MM患者外周血中具有天然杀伤作用的NK细胞的比例虽然只有轻度下降，但也能够提示在骨髓瘤患者中NK细胞的正向免疫能力也是有所下降的。这些主要免疫细胞的比例变化进一步说明了在MM患者外周血中存在免疫功能的匮乏和失调。

Treg是一群具有促肿瘤免疫耐受和免疫逃逸的负向免疫功能的细胞群体，且其在多种肿瘤中均表现明显的负向调控作用[4]。根据其表型，通常被定义为CD4+CD25+FoxP3+T细胞或者定义为CD4+CD25+CD127low/-T细胞。本实验发现，在骨髓瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127low/-T细胞(Treg)显著升高，这一结果与FENG等[5]的研究结果一致，提示在骨髓瘤患者外周血中存在严重的免疫逃逸和免疫抑制。根据文献报道，Tregs在肿瘤免疫中的作用机制主要是通过释放大量的转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素10(IL-10)等因子抑制T细胞的增殖和活化[9]。已有文献报道了Treg细胞的免疫抑制机制，在肺癌患者中Treg细胞已成为一个潜在治疗靶点[10]，因此在抗肿瘤免疫治疗中，Tregs可能会成为一个很有前途且应用广泛的潜在治疗靶点[11]。但其在肿瘤免疫治疗中的有效性还没有得到充分确定，因此，进一步的深入研究是必不可少的[4]。

综上所述，本研究较为系统地分析了MM患者外周血中主要免疫细胞的比例变化，即具有免疫抑制功能的Treg细胞显著高于健康人，而反应机体正常T细胞功能的CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例显著低于健康人，以上这些结果表明在骨髓瘤外周血中存在严重免疫功能抑制和免疫匮乏，且Treg细胞有可能成为一个很有效的评估治疗效果的实验室指标。