兽用口服地克珠利纳米乳递药系统的构建及其性质考察

时菲菲，丁 宁，周 芳，高建如，董培培，于生兰

(江苏农牧科技职业学院 动物药学院，江苏 泰州 225300)

地克珠利(Diclazuril)，化学名氯嗪苯乙氰，是三嗪类化学合成抗球虫药物，20世纪80年代由杨森公司开发，该药物具有高效、低毒、广谱等优点，对球虫发育的各个阶段均具有有效的杀灭作用[1]，在畜禽养殖业的球虫病预防和治疗中效果显著[2-3]。但地克珠利具有水溶性差的缺点，目前在兽药市场中应用剂型较少，主要以预混剂为主，极大限制了该药物在临床中的应用。同时由于地克珠利在临床治疗中所应用的剂量较低，其预混剂在使用过程中常出现难以与饲料充分混匀的问题，从而导致畜禽群体的给药剂量均匀性差，治疗效果不均一。纳米乳(Nanoemulsion)递药系统是指粒径在1～100 nm，外观澄清、透明且动力学和热力学稳定的体系[4]，它具有增加难溶性药物的溶解度和生物利用度[5-7]等优点。近年来，纳米乳递药系统已成功用于透皮、口服和注射给药等多种给药途径[8-11]。本研究通过构建兽用口服地克珠利纳米乳递药系统，来提高地克珠利的溶解性并解决其临床给药均匀性差的问题，从而有效提高地克珠利的生物利用度，进一步扩大地克珠利的临床应用。

1 材料和方法

1.1 主要药品与仪器

地克珠利(批号为M0222A，95%)购自大连美仑生物技术有限公司，大豆油(批号为P1246926，药用级)购自上海泰坦科技股份有限公司，N,N-二甲基甲酰胺、蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)、聚乙二醇400(PEG400)均购自成都艾科达化学试剂有限公司。

激光粒度分析仪(Zetasizer Nano ZS型)购自英国Malvern instrument公司，透射电子显微镜(HT7700)购自日本Hitachi公司，磁力搅拌器(JB-2型)购自上海雷磁新泾仪器有限公司，高速离心机(3K30型)购自德国Sigma公司。

1.2 地克珠利纳米乳递药系统的处方筛选与制备

1.2.1 油相的筛选 分别取2 mL的肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、大豆油、橄榄油于5 mL具塞西林瓶中，分别加入过量地克珠利，利用涡旋混合器混匀10 min，于(37±0.5)℃水浴振荡器中振荡72 h后，于3 000 r/min离心15 min，取上清液于277 nm波长处测定吸光度，比较地克珠利在各油相中的溶解度大小，确定适当的油相。

1.2.2 表面活性剂的筛选 选取EL-40、氢化蓖麻油脂(RH-40)、吐温-80、吐温-85共4种表面活性剂，分别与纯水混合制备成2.5 mL的15%表面活性剂水溶液，加入5.0 μL的油相并充分涡旋，待溶液澄清后继续加入5.0 μL的油相，直至溶液最终浑浊，选择油相溶解性最好的表面活性剂用于制备地克珠利纳米乳递药系统。

1.2.3 助表面活性剂的筛选 将筛选出的表面活性剂分别与助表面活性剂乙醇(Ethanol)、异丙醇(IPA)、正丁醇(n-butanol)、PEG400按照表面活性剂-助表面活性剂体积比(Vmix)为1∶1进行混合，再与油相分别按体积比为1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、6∶4(1∶0.70)、7∶3(1∶0.43)、9∶1进行混合制备空白纳米乳，记录纳米乳体系由浑浊变澄清时各组分体积的百分比，最后分别以Vmix、油相、水相为顶点，利用Origin Pro 8.0软件绘制伪三元相图，筛选最佳助表面活性剂。

1.2.4 表面活性剂-助表面活性剂最佳体积比(Smix)筛选 筛选出的Vmix分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶0、1∶2、1∶3，再按照Vmix-油相体积比为1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、6∶4(1∶0.70)、7∶3(1∶0.43)、9∶1进行混合制备空白纳米乳，记录纳米乳体系由浑浊变澄清时各组分体积的百分比，最后分别以Vmix、油相、水相为顶点，利用Origin Pro 8.0软件绘制伪三元相图，分析相图筛选出Smix。

1.2.5 Smix-油相体积比筛选 分析1.2.4中绘制的伪三元相图，筛选出理想的Smix-油相体积比，以确定处方组成。

1.2.6 地克珠利纳米乳递药系统样品的制备 根据筛选出的油相、表面活性剂、助表面活性剂最佳种类及用量制备地克珠利纳米乳递药系统。取处方量地克珠利于50 ℃水浴条件下0.1 mL的N,N-二甲基甲酰胺中，与处方量油相、表面活性剂、助表面活性剂在磁力搅拌器下搅拌2 min混合均匀。边搅拌边向混合溶液中滴加蒸馏水，至溶液澄清、透明、流动性好。

1.3 地克珠利纳米乳递药系统的性质考察

1.3.1 外观鉴别 肉眼观察制备的样品溶液是否呈现澄清、透明或半透明并伴有淡蓝色乳光，且当平行光射入时有丁达尔现象。

1.3.2 类型判定 分别向样品溶液中加入红色油溶性染料苏丹红Ⅲ和蓝色水溶性染料亚甲基蓝，利用2种染料在其中的扩散速度鉴别类型。若蓝色扩散速度明显快于红色扩散速度，可判定为水包油(O/W)型；若红色扩散速度明显快于蓝色扩散速度，可判定为油包水(W/O)型。

1.3.3 冷-热循环稳定性检测 将3 mL样品置于5 mL具塞西林瓶中，于4 ℃恒温条件下放置48 h，取出后再于45 ℃恒温条件下放置48 h，冷-热循环共6次，考察地克珠利纳米乳递药系统的冷-热循环稳定性。

1.3.4 离心稳定性检测 经冷-热循环稳定性考察后的样品于12 000 r/min下高速离心15 min，观察其外观性状是否发生变化，判定地克珠利纳米乳递药系统的离心稳定性。

1.3.5 冻-融稳定性检测 经离心稳定性考察后的样品于-25 ℃恒温条件下放置48 h，取出后再于25 ℃恒温条件下放置48 h，考察地克珠利纳米乳递药系统的冻-融稳定性。

1.3.6 粒径分布及Zeta电位检测 取样品溶液并分别稀释10、100、1 000倍后于激光粒度分析仪下测定粒径分布和Zeta电位值。

1.3.7 微观形态观察 取适量样品溶液，用蒸馏水将其稀释100倍，滴在覆有支持膜的铜网上，静置20 min，滤纸吸干。滴加2%磷钨酸溶液负染5 min，自然挥干，利用透射电镜观察其微观形态。

2 结果与分析

2.1 地克珠利纳米乳递药系统的处方与制备方法

2.1.1 油相筛选 纳米乳递药系统的形成与药物本身的性质密切相关，水溶性好的药物适宜制备成W/O型，油溶性好的药物适宜制备成O/W型，地克珠利水溶性较差，通过检测地克珠利在IPM、大豆油、橄榄油中的溶解度发现，其溶解度顺序为大豆油>橄榄油>IPM。因此，确定大豆油为制备地克珠利纳米乳递药系统最佳油相。

2.1.2 表面活性剂筛选 确定油相为大豆油后，分别考察了EL-40、RH-40、吐温-80、吐温-85共4种表面活性剂对大豆油的溶解能力，结果表明，EL-40对大豆油的溶解能力最强，故选择EL-40为制备地克珠利纳米乳递药系统的表面活性剂。

2.1.3 助表面活性剂筛选 通过绘制伪三元相图筛选乙醇、异丙醇、正丁醇、PEG400，其中形成纳米乳区域面积最大的即可作为助表面活性。绘制的伪三元相图如图1所示，各相图形成纳米乳区域面积大小的顺序为正丁醇<乙醇

2.1.4 Smix的筛选 设置Smix分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶0、1∶2、1∶3时绘制的伪三元相图见图2，当Smix为1∶1时形成纳米乳区域最大，故选择Smix为1∶1。

2.1.5 Smix-油相体积比筛选 通过分析在Smix为1∶1时绘制的伪三元相图发现，Smix-油相体积比为6∶4(1∶0.70)、7∶3(1∶0.43)、9∶1时均可形成纳米乳递药系统，同时以使用低浓度的表面活性剂为原则，故确定Smix-油相最佳体积比为7∶3(1∶0.43)和 6∶4(1∶0.70)。

2.1.6 地克珠利纳米乳递药系统的处方 如表1所示，最终选择大豆油、EL-40和PEG400分别作为最佳油相、表面活性剂和助表面活性剂，选择Smix为1∶1，最佳的Smix-油相体积比为7∶3(1∶0.43)和 6∶4(1∶0.70)，分别以其确定Ⅰ号和Ⅱ号2个处方用于地克珠利纳米乳递药系统的制备。

2.2 地克珠利纳米乳递药系统的性质考察

2.2.1 外观及类型 以2个处方制备的地克珠利纳米乳递药系统均呈现澄清、透明状，且具有淡蓝色乳光，当平行光线射入时出现丁达尔现象。分别经染色法进行鉴别发现，两者的蓝色扩散速度均快于红色扩散速度，因此，以2个处方制备的地克珠利纳米乳递药系统均为O/W型。

图1 不同助表面活性剂的伪三元相图Fig.1 Pseudoternary phase diagrams with different cosurfactants

2.2.2 冷-热循环稳定性 将2个处方制备的样品进行冷-热循环试验发现，均保持外观澄清、透明且流动性好，未出现分层、破乳等现象，冷-热循环稳定性良好。

2.2.3 离心稳定性 将2个处方制备的样品进行离心试验发现，均无分层、破乳现象，离心稳定性良好。

2.2.4 冻-融稳定性 将2个处方制备的样品进行冻-融试验发现，以Ⅰ号处方制备的样品未出现分层、破乳等现象，外观澄清、透明，流动性好，以Ⅱ号处方制备的样品出现分层现象。

2.2.5 地克珠利纳米乳递药系统的粒径分布及Zeta电位 将通过Ⅰ号处方制备的样品用蒸馏水分别稀释10、100、1 000倍后，经激光粒度分析仪测定发现，其平均粒径分别为15.81、15.85、22.44 nm，多分散系数(PDI)为0.096、0.051、0.184，粒子分散较好，粒径分布范围较窄，基本呈正态分布，基本不受蒸馏水稀释作用的影响(图3)。此外，将通过Ⅰ号处方制备的样品用蒸馏水稀释10、100、1 000倍后，测得其Zeta电位分别为-3.180、-1.620、-0.786 mV(图4)。

图2 不同Smix的伪三元相图

Prescription/mgDiclazurilN,N-/mLN,N-dimethylformamide/mLSoybean oil/mL EL-40400/mLPEG400/mLWaterⅠ200.13.03.53.56.0Ⅱ200.14.03.03.06.0

A：稀释10倍； B：稀释100倍； C：稀释1 000倍

A：稀释10倍； B：稀释100倍； C：稀释1 000倍

2.2.6 地克珠利纳米乳递药系统的微观形态 以Ⅰ号处方制备的样品经蒸馏水稀释10倍后用电镜拍照，如图5所示，样品粒子外观呈球形，大小均匀，无黏连。

图5 地克珠利纳米乳递药系统的微观形态

3 结论与讨论

地克珠利是水难溶性药物，主要用于防治动物球虫病[11]，临床治疗使用剂量小，在市场上多以预混剂形式存在。与饲料混合给药的过程中，存在给药均匀性差、剂量难以控制的问题。本研究利用纳米乳化技术将地克珠利制备成O/W型纳米乳递药系统，通过与饮水混合后进行口服给药，能够有效解决给药均匀性差、剂量难以控制的问题。本研究中，利用蒸馏水分别将制备的地克珠利纳米乳样品稀释10、100、1 000倍后发现，地克珠利纳米乳样品外观澄清、透明，平均粒径无明显变化，但随稀释倍数的增大，其Zeta电位值逐渐升高，说明制备的地克珠利纳米乳递药系统在与水以任意比例混合的过程中稳定性良好。

纳米乳递药系统辅料筛选主要包括油相、表面活性剂和助表面活性剂的种类及用量的筛选。对于水难溶性的药物一般适宜将药物溶解于油相中制备成O/W型纳米乳递药系统，油相的筛选是关键步骤，能够影响纳米乳递药系统的载药量及稳定性，且药物在油相中溶解性越好则稳定性越高，如果药物的溶解依赖于表面活性剂或助表面活性剂，则不利于稳定，在稀释过程中易出现由于表面活性剂和助表面活性剂溶解能力降低而导致的药物析出[12-14]。在纳米乳递药系统制备中离不开表面活性剂的使用，但高浓度的表面活性剂会引起一系列毒副作用[13,15]，故应该以尽量使用低浓度的表面活性剂为原则。欧阳艳等[16]利用在60 ℃条件下地克珠利溶于吐温-80的性质，以吐温-80和司盘-80为表面活性剂制备了地克珠利纳米乳，理论上存在稳定性风险，且使用表面活性剂浓度较高，为油相用量的3倍。本研究通过考察地克珠利在不同油相中的溶解度，确定了大豆油作为制备地克珠利纳米乳递药系统的油相，通过考察4种表面活性剂对大豆油的溶解能力，确定了溶解能力最强的EL-40为表面活性剂，再利用伪三元相图筛选Smix，并通过稳定性考察确定了最佳处方，其中Smix-油相体积比为7∶3(1∶0.43)时稳定性好，通过这种方法确定表面活性剂用量最大程度保证了使用较低浓度表面活性剂，以降低毒副作用。

伪三元相图的绘制需要获取大量的试验数据，尤其是在需要准确绘制相图边界的情况下，虽然纳米乳递药系统的形成仅需要较低自由能，且其属于热力学稳定体系，但试验过程中需要谨慎判断呈现出外观澄清、透明的纳米乳体系是否处于亚稳定状态。通过分析伪三元相图可以了解油相、表面活性剂、助表面活性剂和水相混合物相的行为，以确定最佳处方组成。理想的纳米乳递药系统应同时具有热力学稳定性和动力学稳定性[17]。本研究构建的地克珠利纳米乳递药系统分别通过冷-热循环稳定性、高速离心稳定性和冻-融稳定性试验考察表明，其热力学和动力学稳定性良好。

综上，本研究所构建的地克珠利纳米乳递药系统稳定性良好，在养禽业、养兔业球虫病预防和治疗中具有潜在应用价值，有利于地克珠利获得更广的临床应用，值得作为兽用新型纳米制剂进行深入研究。