黄芩根汉黄芩苷提取及复合保鲜液在圣女果贮藏中的应用

张晓虎，杨风婷，殷佳琦，肖秦箭

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

0 引言

在食品保鲜剂研究领域已广泛利用中草药等植物源中有效保鲜成分研发天然食品保鲜剂。药用植物黄芩的提取物能够有效抑制多种细菌生长，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、蜡样芽胞杆菌、沙门氏菌等，从黄芩中提取防腐保鲜物质并用于食品保藏已引起人们关注[1]。

黄芩中的成分极为复杂，主要包括汉黄芩苷等在内的黄酮类物质是其发挥功效的主要活性成分[2～4]。程存归等[5]采用微波辅助水提或有机溶剂提取的方法研究得出黄芩中黄芩苷的最佳提取工艺；李芳等[6]采用微波辅助乙醇回流联合方法从黄芩中提取黄芩苷；梁英等[7]采用二次正交旋转组合试验研究乙醇回流浸提黄芩黄酮的优化工艺；王雪等[8]采用中心组合设计-响应面法研究黄芩中抗菌有效活性成分优化提取工艺；魏长志[9]研究比较表明黄芩对金黄色葡萄球菌和痢疾杆菌的抗菌活性的影响次于黄连而优于黄柏；霍峰岩等[10]研究了不同浓度黄芩提取物对芒果贮藏保鲜效果的影响。但查阅文献未见有关针对黄芩根部汉黄芩苷提取物用于食品防腐保鲜的相关研究报道。

研究选取出自秦岭腹地商洛山区的量大、质优、国内知名的“五大商药”之一的黄芩[11]，采用微波辅助乙醇浸提法从干燥的黄芩根部提取汉黄芩苷，用分光光度法测定汉黄芩苷的含量；根据单因素实验结果设计正交试验，确定最佳提取工艺；做汉黄芩苷抑菌实验，确定最佳抑菌浓度；制备复合保鲜液并用于圣女果的保鲜贮藏。研究结果将为黄芩中汉黄芩苷作为保鲜成分在果蔬保藏中的应用提供技术参考，促进商洛当地黄芩资源的综合开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 材料：两年生黄芩根(2017年9月13日采挖于陕西省商洛市商州区商洛学院中草药种植园)；新鲜圣女果(2018年5月12日采摘于商州区刘湾街道办事处设施蔬菜棚区)。

试剂：汉黄芩苷标准品，无水乙醇，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，抗坏血酸(Vc)，海藻酸钠，氯化钙，酚酞，NaOH溶液，蒸馏水等。

菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌。

1.1.2 仪器 MDS-6G型多通量微波萃取系统，北京安和美诚科学仪器有限公司；755B型紫外可见分光光度计，上海光学仪器仪器有限公司；SI-234型电子分析天平，奥然科技有限公司；202型电热恒温干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；HJH-DNP-9082型恒温培养箱，广州航信科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验材料预处理 将完整挖出黄芩的根部洗净、去其皮及须根，置于烘箱中60℃烘干，高速万能粉碎机粉碎，过40目筛，置于干燥的广口瓶内，密封保存备用。

1.2.2 汉黄芩苷标准曲线的制备 称取汉黄芩苷标准品5 mg，放入50 mL容量瓶中，用50%乙醇定容。用移液管分别移取1、2、3、4、5 mL汉黄芩苷标准品溶液于5个10 mL的容量瓶中，用50%乙醇定容，摇匀，放置10 min，以空白乙醇溶液为对照，用紫外分光光度计在330 nm处测定其吸光度。每个样品测定3组平行，取平均值。绘制标准曲线见图1，得到回归方程y = 13.757x + 0.0076，R2=0.9947，可以此求出汉黄芩苷的含量。

图1 汉黄芩苷标准曲线

1.2.3 黄芩根汉黄芩苷的提取 精确称取黄芩根粉末1 g，按一定料液比加定量乙醇，置于微波萃取系统，选择一定的微波功率进行提取，接受一定的微波辐射时间，待溶剂挥发冷凝回流后，取出冷却至室温，重新置于多通量微波萃取系统中，上述步骤重复操作以累计达到设计的总辐射时间值为至。提取完成后过滤，将上清液转入离心管中，5 400 r·min-1离心15 min获取上清液，即得黄芩根提取液。

1.2.4 黄芩根汉黄芩苷提取率的测定 吸取黄芩根提取液1 mL，以汉黄芩苷为标准，测定波长330 nm处的吸光度，结合1.2.2线性回归方程计算提取液中汉黄芩苷提取率，计算公式如下：

W%=[(C×n×V)+M]×100%

式中：C—提取液浓度，mg·mL-1；n—稀释倍数；V—提取液体积，mL；M—所用黄芩根的质量，mg。

1.2.5 单因素实验 以黄芩根部汉黄芩苷提取率为指标，研究乙醇体积分数(40、50、60、70、80%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、微波功率(300、400、500、600、700 W)、微波加热时间(2、4、6、8、10 min)4个因素对黄芩根中汉黄芩苷提取率的影响[12]。

1.2.6 正交试验设计 依据以上4个考察因素，以汉黄芩苷的提取率为指标，设计4因素3水平的正交试验[13]。

1.2.7 抑菌效果试验 研究汉黄芩苷提取液对大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果，确定最低抑菌浓度[14,15]。

1.2.8 复合保鲜液的配制 选用抗坏血酸、海藻酸钠、氯化钙、汉黄芩苷提取液作为保鲜液配方的组分，采用不同浓度进行试验设计，见表1。

1.2.9 保鲜效果试验 取当日采摘的新鲜圣女果用蒸馏水冲洗干净，晾干后将配方不同保鲜液喷洒至圣女果上，放置在20℃、相对湿度为70%的培养箱中进行贮藏保鲜，对照空白组用蒸馏水处理，间隔1d取样测定防腐保鲜效果指标[16,17]。圣女果的感官品质、腐烂率、失重率均用全部果实测定；可滴定有机酸含量测定的圣女果，随机取样、破碎、匀浆。试验均重复3次，取其平均值。

感官品质：观察圣女果外观、色泽，测定硬度，评价风味与口感，判断其优劣状况。

腐烂率% =(腐烂果实质量/总果实质量)×100 %

失重率% = [(原重-实重)/原重]×100 %

可滴定酸含量：每组称取圣女果100 g，去掉果皮后匀浆，量取5 mL浆液，蒸馏水定容至50 mL后过滤并收集滤液，酚酞作指示剂，用标准NaOH溶液滴定，以柠檬酸为折算系数，以碱液的耗量计算可滴定酸的含量。同时以蒸馏水做空白对照，此时测定的即为圣女果果肉中有机酸的含量。

表1 汉黄芩苷复合保鲜液配方

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇体积分数对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响 如图2所示，汉黄芩苷提取率随乙醇体积分数增加而逐渐增加；达到50%后，汉黄芩苷提取率又迅速下降，结果显示并非乙醇体积分数越高提取率越高，其作用浓度范围是一定的。究其原因：一是微波加热是直接作用于介质分子，乙醇和水都是极性分子，但两者在结构上有较大差异，须有一定比例关系才能使效果达到最佳。二是虽然乙醇溶液对汉黄芩苷具备良好的溶解性，但在一定浓度范围内，汉黄芩苷的溶解效果较好。因此，选取50%作为较佳的乙醇体积分数。

2.1.2 料液比对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响 如图3所示，汉黄芩苷的提取率随着料液比的增加而增加，但在料液比为1∶15之后又开始下降，即当料液比为1∶15时提取率最高。因此，选择1∶15作为较佳的料液比。

2.1.3 微波功率对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响 如图4所示，在500W微波功率范围内，随着微波功率的升高，提取率逐渐增大。功率500W时，提取率达到最大。由此可知，随着微波功率的增加，黄芩细胞破坏更充分，更多的汉黄芩苷从原料中溶出。因此，选取500W作为最佳的微波功率。

2.1.4 微波加热时间对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响 如图5所示，汉黄芩苷提取率随加热时间推移有所增加，当加热时间为6 min时，提取率最大。当加热时间继续上升时，提取率开始下降，这是因为微波可以瞬间产生大量热量，温度过高、加热时间过长可能会对汉黄芩苷有破坏作用。因此，选取6 min作为最佳加热时间。

2.2 正交试验结果与分析

选取乙醇体积分数(A)、料液比(B)、微波加热时间(C)、微波功率(D)为影响黄芩根汉黄芩苷提取率的因素，黄芩苷的提取率为指标，设计4因素3水平的正交试验。正交试验设计及结果见表2。

图2 乙醇体积分数对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响

图3 料液比对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响

图4 微波功率对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响

图5 微波加热时间对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响

实验号因素 A乙醇体积分数/%B料液比/(g·mL-1)C微波加热时间/min D 微波功率/W汉黄芩苷提取率/%11(40)1(1∶10)1(4)1(400) 0.020212(1∶15)2(6)2(500)0.026313(1∶20)3(8)3(600)0.03642(50)123 0.03952231 0.04562312 0.01573(60)132 0.02583213 0.02993321 0.040K10.0820.0840.0640.105K20.0990.1000.1050.066K30.0940.0910.1060.104k10.0270.0280.0210.035k20.0330.0330.0350.022K3 0.031 0.0300.0350.035R 0.017 0.016 0.042 0.039

由表2结果可知，根据极差分析判定对黄芩根汉黄芩苷提取率的影响因素大小依次为：微波加热时间>微波功率>乙醇体积分数>料液比。由正交试验结果可得出最佳水平组合为A2B2C3D1。因此，经正交设计优化后的提取条件为乙醇体积分数50%、料液比1∶15、微波加热时间8 min、微波功率400 W。

2.3 抑菌试验结果与分析

表3 汉黄芩苷对三种供试菌种的抑菌效果

注：表中“-”表示无菌长出；“+”表示有少量菌落长出；“++”表示有大量菌落长出；“+++”表示培养皿几乎长满菌落。

由表3抑菌效果分析可得：金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.20 mg·mL-1；枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌最低抑菌浓度为0.50 mg·mL-1。

2.4 保鲜效果试验结果与分析

2.4.1 感官指标趋势分析 如图6所示，随着保藏时间延长，不同浓度复配保鲜液处理的圣女果的综合感官评分均为下降趋势。由实验可以看出，圣女果经复合保鲜液处理后，综合感官评分虽下降但圣女果感官出现了不同程度变化，第8组处理对综合感官评分变化最小，空白对照组综合感官评分下降最明显速度最快，说明复合保鲜液能明显的改善圣女果的感官品质。

2.4.2 腐烂率指标趋势分析 如图7所示，随着保藏时间的延长，圣女果的烂果率呈上升趋势，且于3 d后大幅上升； 7 d时处理1在抑制圣女果腐烂方面的效果最差，烂果率已经高达39%，而处理8果实的烂果率显著低于其他处理为22%，空白对照组效果最差。

2.4.3 失重率指标趋势分析 如图8所示，随保藏时间延长，圣女果的失重率随之增加，其中处理8上升的趋势最缓慢，7 d时失重率为3.9%，而处理2已经达到7.8%，空白对照组上升迅速，圣女果失水严重。从失重率指标可知，最佳复配组合是处理8。

2.4.4 可滴定有机酸趋势分析 圣女果中的有机酸在贮藏期间，部分通过呼吸作用被消耗，部分在果肉内转化为糖分。如图9所示，在贮藏中的酸含量整体呈下降趋势，第8组处理下降速度稍慢，可见复配保鲜液有效延缓了圣女果贮藏期间可滴定酸含量的下降趋势，有利于提高圣女果贮藏保鲜效果。

图6 综合感官指标随保藏时间变化趋势

图7 腐烂率随保藏时间变化趋势

图8 失重率随保藏时间变化趋势

图9 可滴定有机酸随保藏时间变化趋势

3 结论与讨论

3.1 结论

以商洛黄芩为研究对象，采用微波辅助乙醇浸提正交试验的方法优化黄芩根中汉黄芩苷的提取工艺；在汉黄芩苷抑菌实验的基础上，制备汉黄芩苷提取物与海藻酸钠、氯化钙和抗坏血酸复合保鲜液并用于圣女果保藏，得到以下结论：

(1)基于正交试验优化取得的汉黄芩苷提取工艺参数为：乙醇体积分数50%、料液比1∶15、微波加热时间8 min、微波功率400 W。影响提取率的因素大小依次为微波加热时间>微波功率>乙醇体积分数>料液比。

(2)抑菌实验表明：当金黄色葡萄球菌中汉黄芩苷的添加浓度超过0.20 mg·mL-1，枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌添加浓度超过0.50 mg·mL-1时，表现出抑菌效果。

(3)制备的复合保鲜液最优配方为：海藻酸钠浓度1.2%、氯化钙2.0%、抗坏血酸1.5%、汉黄芩苷0.5%；使用该配方能有效改善圣女果贮藏期间的感官品质，抑制失重率及腐烂率的上升，延缓可滴定酸含量下降趋势，保鲜效果良好。

3.2 讨论

(1)研究采用微波辅助乙醇浸提黄芩根汉黄芩苷，微波辅助法能够破坏植物细胞壁，加速汉黄芩苷溶出，比传统方法省时省力且安全无污染，利于提高提取率。

(2)研究取得的有关黄芩根中汉黄芩苷提取工艺参数，对汉黄芩苷的抑菌效果及最低抑菌浓度进行初步研究，未对汉黄芩苷进行分离纯化处理。结果表明黄芩根汉黄芩苷对大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有一定抑制效果，试验结果与黄芩有效抑菌成分的研究结论基本一致[18]。

(3)建议在以后的研究中注意：适宜的微波加热时间是影响汉黄芩苷提取率的重要因素，因为微波可以瞬间产生大量热量，温度升高，加热时间过长会对汉黄芩苷有破坏作用，因此需控制微波加热时间，否则会造成有效成分流失，降低汉黄芩苷提取率。