产ESBL及非产ESBL大肠埃希菌整合子分布差异与耐药性分析

徐令清,朱卓均,汤英贤,温伟洪,李玉珍,钟国权,王 欢,李介华

(广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院检验科，广东清远 511518)

大肠埃希菌是肠道内重要的正常菌群，当机体抵抗力低下或细菌侵入肠道外组织器官后，可引起相关疾病，如败血症、尿路感染、肺炎等[1]。近年来，大肠埃希菌的耐药性逐步增加，超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是其耐药的主要机制，ESBLs存在多种基因型,各个国家和地区流行的种类各不相同[1]。ESBLs是一种水解青霉素、头孢菌素及单胺类的酶。ESBLs阳性的菌株不仅对β-内酰胺酶类抗菌药物耐药,且对其他抗菌药物耐药严重,给临床用药带来诸多不便[2]。整合子作为一种可移动的基因元件，不仅可利用位点特异性重组系统在细菌之间传播，并且具有捕获耐药基因盒的功能[3]。本文通过基因扩增和测序的方法研究整合子在产ESBLs和非产ESBLs的大肠埃希菌中的分布和整合子携带耐药基因盒的种类。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集本院从2018年1月至2018年8月临床标本分离出的大肠埃希菌89株，质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923以及大肠埃希菌ATCC25922。89株大肠埃希菌中产ESBLs菌株49株，非产ESBLs菌株40株。排除同一患者在一次住院期间同类型标本分离的同种菌株。其中尿液43株，伤口分泌物9株，血液7株，痰液、脓液、分泌物、引流液、胆汁等其他标本30株。

1.2仪器与试剂 细菌鉴定以及药敏试验使用BD phoenix100(美国BD公司)全自动细菌鉴定仪及其配套鉴定药敏卡；分离培养基采用哥伦比亚血琼脂平板(广州市迪景微生物科技有限公司)；提取核酸时采用细菌DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司TIANGEN)；扩增、电泳仪器及结果分析使用S1000TMPCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)、Power PacTMBasic 电泳仪(美国BIO-RAD公司)以及Gel DoxTMXR+紫外凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)，试剂选用天根科技有限公司(TIANGEN)生产的Taq PCR MasterMix，GelRed核酸染料以及Marker Ⅱ、Ⅲ DNA Ladder 成品；引物由英骏生物技术有限公司合成。

1.3方法

1.3.1细菌总DNA 提取 临床分离菌株经无菌纯牛奶-80 ℃冷冻保存，于使用前复苏，使用哥伦比亚血平板分离过夜培养，挑取适量菌量加入无菌生理盐水中悬浮备用；按照TIANGEN公司细菌组DNA提取试剂盒说明书的步骤提取，将最后洗脱后的DNA产物至于1.5 mL规格的无菌EP管中，-80 ℃冷冻保存。

1.3.2引物设计 参照参考文献[5-6]，Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类整合子的整合酶基因和可变区所用的引物序列见表1。

1.3.3整合酶基因PCR 检测 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子 PCR反应体系[4]为：2×Taq PCR masterMix 12.5 μL，其中包含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等，上下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL(浓度统一稀释至100 ng/μL)，补充ddH2O至25 μL；反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，以100～1 200 bp的MarkerⅡ DNA Ladder作为条带参照，电压为80 V，取5 μL产物点样在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳60 min，使用BIO-RAD公司的凝胶成像系统分析并处理结果。

1.3.4可变区PCR检测 整合子可变区PCR反应体系[4]为：2×Taq PCR masterMix 25 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL(浓度统一稀释至100 ng/μL)，补充ddH2O至50 μL；反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，以200～4 500 bp的MarkerⅢ DNA Ladder作为条带参照，电压为80 V，取5 μL产物点样在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳60 min，使用BIO-RAD公司的凝胶成像系统分析并处理结果。

表1 3类整合酶基因以及可变区引物序列

1.3.5可变区测序分析 可变区PCR检测后，电泳结果显示有明显条带的产物交由上海生物工程有限公司进行纯化和测序分析，测序图谱结果使用Chromas软件进行序列拼接校正，使用BLAST(www.pubmed.com)进行序列比对分析，选择匹配度最高的结果。

1.4统计学处理 药敏结果使用SPSS18.0进行统计分析，耐药率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1科室分布情况 49株产ESBLs大肠埃希菌菌株中，送检自泌尿外科的有8株；其次是胃肠外科7株、肝胆外科6株以及重症监护室(ICU)和妇科各5株，其余科室散发存在；40株非产ESBLs菌株中，泌尿外科12株，其次是肝胆外科8株，其他科室散发存在。

2.2整合酶基因分布 89株肺大肠埃希菌共检出Ⅰ类整合子阳性菌株36株，检出率为40.4%；其中产ESBLs菌株中占49.0%(24/49)，非产ESBLs菌株中占30%(12/40)；未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子。部分Ⅰ类整合子阳性PCR电泳结果如图1所示。

2.3Ⅰ类整合子与各种抗菌药物耐药率的关系 Ⅰ类整合子阳性的菌株对各类抗菌药物的耐药率除阿米卡星、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和美罗培南之外均高过Ⅰ类整合子阴性的菌株。见表2。

2.4整合子可变区扩增结果 经过PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳后，出现明显条带的标本有15株，其片段长度为800～2 000 bp之间，大小不等。见图2。

注：Marker为100～1 200 bp；泳道1～9为Ⅰ类整合酶基因阳性标本，对应的原始编号为2、6、8、9、10、11、12、16、17；泳道10为空白对照

图1部分Ⅰ类整合酶基因PCR扩增结果

注：M为Marker；泳道1～15分别为6、8、10、11、12、16、20、30、32、35、39、42、71、77、79菌株；16为空白对照

图215株阳性标本可变区PCR结果

2.5基因盒测序结果 结合琼脂糖凝胶电泳条带分析，把15株可变区阳性菌株送去测序。测序结果显示，15株可变区阳性的菌株全部检测出基因盒。其携带的基因盒类型如表3及图3所示，共检出5种耐药基因。

表2 89株大肠埃希菌Ⅰ类整合子阳性菌株和Ⅰ类整合子阴性菌株的耐药表型比较(%)

续表2 89株大肠埃希菌Ⅰ类整合子阳性菌株和Ⅰ类整合子阴性菌株的耐药表型比较(%)

注：-表示无数据

表3 耐药表型与可变区基因盒组合比较

注：对20种抗菌药物进行分类，可以分为9类，其中a类为碳青酶稀类，亚胺培南、美罗培南；b类为氨基糖苷类，庆大霉素、阿米卡星；c类为喹诺酮类，环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星；d类为头孢菌素类，头孢唑啉、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟；e类为广谱青霉素类，氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林；f类为β-内酰胺类，氨曲南、氨苄青霉素；g为磺胺类，复方新诺明；h为四环素类，四环素；i为酰胺醇类，氯霉素；-表示无数据

图3 本次检出整合子结构图

3 讨 论

根据近年来中国细菌耐药监测网(CHINET)报告，大肠埃希菌是临床分离的最常见的病原体之一[6]。近年来，临床大量使用β-内酰胺类抗菌药物，导致产ESBLs大肠埃希菌逐渐增多。ESBLs可由质粒介导，通过接合、转化、转导、整合子等使耐药基因在同种属或不同种属间细菌进行传递，给临床治疗带来较大困难。

整合子广泛存在于革兰阴性菌中，其与细菌耐药性密切相关[7]。因此本次研究对临床分离的产ESBLs及非产ESBLs的89株大肠埃希菌进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子、可变区分析，从而对本院ESBLs大肠埃希菌的耐药情况以及院内感染趋势提供相应的依据。通过Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子的检测发现，Ⅰ类整合子阳性共36株，检出率为40.4%；其中产ESBLs大肠埃希菌的Ⅰ类整合子阳性检出率为49.0%，非产ESBLs大肠埃希菌的Ⅰ类整合子阳性检出率为30%；并未检出Ⅱ、Ⅲ类整合子；由此可见，Ⅰ类整合子在产ESBLs和非产ESBLs的大肠埃希菌中的分布差异较为明显。另外，本次实验还发现来自胃肠外科的7株产ESBLs菌株中，有4株检测出Ⅰ类整合子阳性，检出率为57.1%；另来自胃肠外科的4株非产ESBLs的菌株中，均未检测出Ⅰ类整合子，与前者存在明显的差异。

通过统计分析，氨苄青霉素的耐药率为100%，阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦耐药率较低，均在10%以下，而本次实验所用到的89株大肠埃希菌，亚胺培南、美罗培南以及阿米卡星为全敏感，与相关文献报道基本一致[7]，提示临床可以根据患者感染情况按照限制级别选择用药；对四环素、环丙沙星、头孢唑啉、哌拉西林、头孢噻肟、氨曲南、复方新诺明和氯霉素等药物，Ⅰ类整合子阳性菌株的耐药率明显高于阴性菌株，这代表着其耐药机制与Ⅰ类整合子存在紧密联系。

整合子是一种重要的耐药基因捕获及传播元件，可位于染色体、质粒或转座子上，携带一个或多个与抗菌药物和消毒剂抗性有关的基因盒的遗传单位；基本结构有5′保守区(5′CS)、3′保守区(3′CS)、可变区(VR)3个部分组成。可变区可同时插入一个或多个基因盒，基因盒是由重组位点attC和基因编码区组成，这些基因盒作为独立的功能单位可单独移动[8-9]。整合子可分为抗性整合子和超级整合子两大类。抗性整合子按整合酶intI序列同源性差别分成6类。国外研究表明，临床耐药菌中整合子普遍存在，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子与细菌耐药性相关[10-12]，其携带的耐药基因盒所编码的产物几乎能对抗临床上大多数抗菌药物，整合子阳性株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物的耐药率高于整合子阴性菌株[13-14]。

在本研究中只检测到Ⅰ类整合子，未检测到Ⅱ、Ⅲ类，整合子阳性菌株其耐药性显著高于整合子阴性菌株，与文献报道相符[15-16]。89株大肠埃希菌中扩增出可变区的有15株，共检出5种耐药基因盒。其中aadA22、aadA2、aadA5为编码氨基糖苷类药物的耐药基因[15];dfrA12、dfrA17为编码磺胺类药物的耐药基因[17]，本次检测的耐药基因与耐药表型有一定关联却没有完全相符，可能还存在其它耐药机制，需进一步研究。

综上所述，Ⅰ类整合子的携带与细菌的耐药性有着密切的联系，其可变区所携带的基因盒具有多样性，与耐药机制有一定的对应关系。应加强研究，以更深入地了解细菌耐药的发生和传播,为医院感染的流行和传播及选用抗菌药物提供依据。

4 结 论

Ⅰ类整合子在ESBLs和非产ESBLs的大肠埃希菌中的分布存在较为明显的差异，且与耐药表型存在一定的相关性，显示其与细菌的耐药性关系紧密，应予以足够重视。