宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的表达及其意义

史跃燕，鞠少卿，申娴娟，张金业，朱自力，顾益凤

(1.南通市肿瘤医院检验科，江苏南通 226000；2.南通大学附属医院外科综合实验室，江苏南通 226000)

宫颈癌(CC)是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，并且发病率有升高的趋势。据报道，中国每年新确诊的病例约为13万例，占全球28.8%[1]。研究表明人乳头状瘤病毒(HPV)感染和基因突变是宫颈癌发生的重要因素[2]。

微小核糖核酸(miRNA)是一种小分子非编码单链RNA，在细胞内的调节基因方式呈网状，即一个miRNA可调节多个靶基因，一个基因也可由多个miRNA调节。有文献报道称，人类基因的1/3由miRNA调控[3]。miRNA结合位点的SNP能使信使RNA靶基因的功能发生改变，从而使得癌症更加易发并能推进肿瘤的进展[4]。已有研究表明，在亚洲人中，miRNA单核苷酸的多态性与患癌风险之间的相关性更加明显[5]。因此，miRNA可作为肿瘤辅助诊断、疾病监测、疗效评价及肿瘤形成机制研究的潜在肿瘤标志物[6]。同时研究表明，外周血中的miRNA反复冻融、酸碱处理及长期保存等均能稳定存在[7]，为miRNA的血清学研究提供了可能性。故许多学者认为血清miRNA的这些生物学特性可用于宫颈癌的早期诊断、疗效监测、机制研究及靶向治疗。

有文献报道，miR-200家族通过对目的基因的调控影响肿瘤细胞的迁移及侵袭等生物学过程，从而参与肿瘤的发生、发展[8]。张占薪等[9]的研究表明宫颈癌组织has-miRNA-200b表达水平明显高于癌旁宫颈组织。本文通过分析55例CC患者、32例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者、39例子宫肌瘤患者及47例健康对照者的血清样本hsa-miR-200a-3p表达水平的变化，探讨其在宫颈癌辅助诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 本次实验所有血清标本均来自南通市肿瘤医院，患者为2015年11月至2016年6月收治的未经任何治疗的初诊住院患者，55例CC患者：年龄34～84岁，平均57岁；32例CIN患者：年龄28～80岁，平均47岁；39例子宫肌瘤患者：年龄33～86岁，平均50岁；47例健康对照：年龄22～61岁，平均43岁。所有患者均经病理组织学或细胞学证实，入院前未经任何放化疗及抗肿瘤治疗。健康对照纳入标准：血糖、血脂、肝肾功能均无异常、无妇科疾病及其他并发症的体检者，各组间年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理学委员会批准，所有受试者知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集及血清总RNA提取 用真空采血法采集各研究对象的空腹肘静脉血，自然凝固后离心1 000 r/min离心10 min，将上层血清分装于无核糖核酸酶的EP管中，唯一性编号，-80 ℃冰箱保存备用。总RNA提取用北京百泰克生物技术有限公司(BioTeke Corporation)试剂盒提取，纯度经分光光度计测定合格后逆转成cDNA。

1.2.2RNA逆转录为互补cDNA 将RNA逆转录为互补cDNA，逆转录试剂盒、hsa-miR-200a-3p及内参U6茎环逆转录引物分别由美国Thermo公司、上海捷瑞生物科技有限公司提供。逆转录反应体系为：RNA 300 ng，5×缓冲液 4 μL，10 μM茎环状逆转录引物1 μL，dNTP(10 nM)2 μL，核糖核酸酶抑制剂(20 U/μL)1 μL，反转录酶(200 U/μL)1 μL，无核酸酶水补足至20 μL。

1.2.3实时荧光定量PCR测定 hsa-miR-200a-3p正向引物：5′-GCG CCT AAC ACT GTC TGG TAA-3′，hsa-miR-200a-3p反向引物：5′-CAG CCA CAA AAG AGC ACA AT-3′；U6正向引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6反向引物：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′，反应体系为：SYBR GreenⅠmix(Rox)10 μL，cDNA4 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，无核酸酶水5 μL，混匀后短暂离心。PCR反应条件为：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；58 ℃，32 s，40个循环，hsa-miR-200a-3p和内参U6均做3个复孔，取均值，hsa-miR-200a-3p的相对表达水平(RQ)用2-△△Ct法表示，△△Ct=实验组(CtmiRNA均值-CtU6均值)-对照组(CtmiRNA均值-CtU6均值)。SYBR GreenⅠ染料和7500实时定量PCR扩增仪分别来自德国罗氏(Roche)公司和美国ABI公司。

1.2.4血清糖链抗原125(CA125)和人鳞状细胞癌相关抗原(SCCAg)测定 分别采用德国罗氏(Roche)诊断有限公司的E601化学发光仪和深圳市新产业生物医学工程有限公司的Maglumi全自动化学发光仪测定CA125和SCCAg水平。

1.3统计学处理 统计分析运用SPSS21.0软件；数据用[M(P25，P75)]表示；多个独立样本比较采用Kruskal-WallisH检验，多样本两两比较采用Mann-WhitneyU检验；相关性检验用Spearman分析；用受试者工作特征曲线(ROC曲线)获得cut-off值，并评价各检测指标的诊断价值；检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1hsa-miR-200a-3p的相对表达量 CC、CIN患者、子宫肌瘤患者和健康对照者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量分别为1.871(1.124，5.096)、1.638(0.615，3.875)、0.980(0.522，1.760)和0.891(0.495，1.600)。CC患血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量者高于子宫肌瘤患者和健康对照者，差异有统计学意义(P<0.001)；CIN患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量者高于子宫肌瘤患者和健康对照者，差异有统计学意义(P<0.05)，但与CIN患者差异无统计学意义(P>0.05)。子宫肌瘤患者和健康对照者hsa-miR-200a-3p的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 血清hsa-miR-200a-3p在CC组、CIN组、子宫肌瘤组

2.2CC患者血清hsa-miR-200a-3p相对表达量与临床病理特征的关系 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量在不同年龄、绝经与否、肿瘤最大直径及FIGO分期间差异均无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

2.3血清hsa-miR-200a-3p相对表达量与糖类抗原125(CA125)、SCCAg的相关性分析 CC患者血清hsa-miR-200a-3p相对表达量与CA125、SCCAg之间无相关性(r2=0.012，P=0.421；r2=0.004，P=0.647)。见图2、3。

2.4ROC曲线分析 CC患者和子宫肌瘤患者比较，hsa-miR-200a-3p的cut-off值为1.784，ROC曲线下面积(AUC)为0.753[95%置信区间(CI)：0.675～0.850]，诊断效能见图4。CC患者和健康对照者比较，hsa-miR-200a-3p的cut-off值为1.502、AUC为0.771(95%CI：0.682～0.860)。诊断效能见图5。

表1 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量

图2 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相对

图3 CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相对

图4 CC患者区分于子宫肌瘤时各指标的ROC曲线

图5 CC患者区分于健康对照时各指标的ROC曲线

表3 区分于健康对照者时各指标对CC诊断

2.5hsa-miR-200a-3p、CA125和SCCAg联合检测诊断CC的价值 ROC曲线分析表明，在区分CC和子宫肌瘤时，hsa-miR-200a-3p和SCCAg的灵敏度和特异度均相似，而CA125的特异度仅为12.8%，联合前两者检测的灵敏度和特异度分别为78.2%和79.5%，此时联合检测hsa-miR-200a-3p和SCCAg更合适。在区分CC和健康对照时，hsa-miR-200a-3p和SCCAg灵敏度相同，且高于CA125，SCCAg特异度最高。在单项检测中SCCAg的诊断准确率最高，SCCAg联合hsa-miR-200a-3p的诊断准确率高于SCCAg联合CA125。见表2、3。

3 讨 论

CC的早期发病症状隐匿，对于未定期进行宫颈筛查的女性很难及时发现，当出现明显症状而就诊时往往处于癌症中晚期，其疗效和预后均不理想。研究表明，miRNA在CC组织中的升高或降低与CC的发生、发展密切相关[10]。

miR-200a属于miR-200家族成员，在不同的肿瘤中发挥不同的作用，与miR-141有着共同的序列“AACACU”。其中miR-200a、miR-200b及miR-429基因簇位于人体的1号染色体p36.33区，而miR-200c和miR-141基因簇位于人体的12号染色体p13.31区，这2个区域容易发生染色体缺失、易位或点突变，进一步导致肿瘤的发生。

miR-200家族可抑制E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)和ZEB2的表达从而抑制肿瘤的上皮-间质转变，最终抑制肿瘤细胞迁移和侵袭过程。miR-200a下调ZEB2的表达进而抑制CD133/1+鼻咽癌细胞和卵巢癌干细胞的迁移和侵袭[11-12]。miR-200a能够对NCAM1mRNA的3′-UTR进行负调控，从而导致NCAM1基因所编码的NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180蛋白水平下调[13]。张占薪等[9]研究表明CC组织中has-miRNA-200b的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。CAO等[14]研究表明miR-200a、miR-200b和miR-200c在上皮性卵巢癌组织中处于明显高表达状态，并与生存期呈负相关。miR-200家族在胃癌组织中的呈低表达水平状态，与正常对照组织之间差异有统计学意义(P<0.05)[15]。因此可以认为，miR-200家族对不同的肿瘤发挥着不同的生物学功能。

本次研究通过对55例CC患者、32例CIN患者、39例子宫肌瘤患者和47例健康对照者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量进行检测，并进行统计分析：CC患者和CIN患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，CC组和子宫肌瘤患者、健康对照者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量差异均有统计学意义(P<0.001)；CIN患者和子宫肌瘤患者、健康对照者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05)；子宫肌瘤患者和健康对照者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。

通过对血清hsa-miR-200a-3p的表达水平与临床病例特征之间关系的研究表明，其相对表达量在不同年龄、绝经与否、肿瘤最大直径及FIGO分期之间差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究结果提示，CC患者血清hsa-miR-200a-3p水平升高，应用实时荧光定量PCR测定CC患者血清中的hsa-miR-200a-3p水平对CC具有一定的辅助诊断价值，在单独诊断时诊断效能低于SCCAg，高于CA125，联合hsa-miR-200a-3p和SCCAg，可提高对CC的诊断效能。hsa-miR-200a-3p可能成为CC诊断的重要血清标志。

大多数CC由CIN转变而来，CC重要的危险因素是高危型HPV的长期感染。研究表明，基质金属蛋白酶(MMP)、MMP2在HPV阳性CC细胞中水平明显高于HPV阴性细胞，miR-200a的高表达可导致MMP2的表达水平升高[16]，在本研究中，CIN患者的hsa-miR-200a-3p水平也升高，因而可以设想hsa-miR-200a-3p可能参与由HPV感染引起宫颈病变的过程，为进一步阐明CC的发生机制及CC的预防和治疗提供新思路。

4 结 论

CC患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量高于子宫肌瘤患者和健康对照者，有可能成为CC辅助诊断的重要生物学指标，血清hsa-miR-200a-3p的表达水平或可用于CIN的辅助诊断。