携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定

于水澜，姜 颖，于英君，宋高臣

(1.黑龙江中医药大学基础医学院,黑龙江 哈尔滨150040;2.牡丹江医学院,黑龙江 牡丹江157011)

研究发现，肝癌的发生是多因素、多基因相互作用的结果，与肿瘤相关的癌基因的过度表达或抑癌基因的表达缺失都会导致肿瘤的发生。目前除了传统的化疗、放疗及手术治疗外，靶向基因治疗成为研究热点[1]。腺相关病毒(AAV)具有感染范围广、免疫反应低、定点整合、携带的外源基因可持续稳定表达等特点，目前已成为基因转移最为理想的载体之一[2]。CDK2基因是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)家族的成员之一，在细胞周期G1/S期的转换过程中起着限速作用[3-5]。本实验以此作为肝癌基因治疗靶点，以AVV作为基因转导载体[6-9]，构建rAAV-shRNA-CDK2，希望能为肝癌基因治疗提供新的理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒载体pAKD-shRNA、包装质粒 pAAV-RC 和辅助质粒pHelper均购自上海艾博思生物科技有限公司(见图1，图2，图3)；感受态细胞株DH5α，购自Takara公司；HEK-293细胞，购自上海艾博思生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1重组质粒pAKD-shRNA-CDK2的构建

利用KpnⅠ和BgIⅡ酶将质粒载体按酶切反应体系进行酶切处理，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将前期设计合成的针对靶基因的特异性siRNA序列上添加KpnⅠ(-GTAC-)和BgIⅡ(-GATC-)内切酶的酶切位点序列与转录终止序列，合成完整的shDNA序列。经退火反应后，形成两端带有KpnⅠ和BgIⅡ酶切位点的双链寡核苷酸片段，标记为CDK2-shRNA。双链DNA连接入酶切载体，取100 μl感受态细胞加入10 μl 连接产物进行转化，根据CDK2-shRNA序列设计一对PCR引物：Primer(+):5′-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3′；Primer(-):5′-TAAAGGGAACAAAAGCTGGGTA-3′，进行菌落PCR鉴定及DNA测序。

图1 质粒载体pAKD-shRNA 图2 包装质粒pAAV-RC 图3 辅助质粒pHelper

1.2.2重组腺相关病毒的包装、纯化

常规方法培养AAV-293细胞，观察细胞生长情况，当细胞达到70-80%融合时采用AAV Helper Free系统将三质粒共转染AAV-293细胞，进行重组腺相关病毒的包装。转染结束后，更换10 ml 新鲜的培养液放置培养箱中继续培养72 h，荧光倒置显微镜下观察细胞中报告基因 EGFP 的表达情况，以便判断是否共转染成功。进一步对病毒进行收集、浓缩和纯化。

1.2.3病毒载体滴度测定

对重组腺相关病毒rAAV-shRNA-CDK2采用定量PCR的方法进行滴度测定。将待测病毒样品用DNase和RNase于37℃消化2-3 h，提取病毒DNA，沸水浴5 min使之变性，立即置于冰上2 min，将病毒样品与标准品做倍比稀释成不同浓度，进行定量PCR检测，所用引物为：forward：5′-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3′，reverse：5′-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3′。PCR结束后，根据标准品绘制标准曲线，计算病毒样品滴度，单位用v.g/ml来表示。

2 结果

2.1 质粒载体的线性化

将质粒载体利用Bgl II和KpnI酶进行酶切处理，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现在大约6 943 bp处出现阳性条带(见图4)。

2.2 转化菌质粒鉴定

为了证明转化菌质粒含有正确序列的shDNA，我们挑取白色阳性克隆菌落进行PCR检测。对结果进行2%琼脂糖凝胶电泳分析，第4、6泳道在大约174 bp处可见阳性条带，与预期结果一致，表明此阳性菌落含有目的DNA片段，转化成功(见图5)。取6号转化子进行DNA测序，测序引物为Primer(+)：5′-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3′。

2.3 重组载体序列测定分析

采用DNAStar的MegAlign软件进行序列比对分析，结果证实所选送测序的碱基为正确序列的shDNA，寡核苷酸片段位于177位至241位(65个碱基)处 (见图6)。

图4 载体酶切图谱

图5 菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳

注：N，M分别为阴性对照组和Marker DL2000，第1-10泳道为转化子样本。

图6 DNA测序报告

2.4 共转染AAV-293细胞的转染效率

于三质粒共转染AAV-293细胞后48 h光镜下观察，细胞呈现不规则的多角形，贴壁状态良好，胞浆透亮，胞核隐约可见(图7)，在荧光显微镜下可以看到绿色荧光布满整个细胞，分布较均匀(图8)，提示转染效率符合实验要求。

图7 自然光源下观察 rAAV转染48 h(200×) 图8 荧光观察rAAV转染48 h(200×)

2.5 病毒滴度检测

采用定量PCR方法进行滴度检测，绘制标准曲线，，表明线性关系非常好(R2=0.999 4)，通过比对标准曲线计算病毒基因组拷贝数，其平均滴度为3.56×1012v.g/ml(见图9)。

图9 标准曲线

3 讨论

近年来AAV由于其宿主细胞广、能够长期稳定表达以及免疫原性低等优势已被广泛应用于基因治疗领域。本实验利用AAV Helper Free系统进行病毒包装，消除了活的辅助病毒及产生野生型AAV的危险，该系统是一个更安全、更方便，并且可以替代逆转录病毒和腺病毒的基因送递系统，提高了我们实验的生物安全级别[10,11]。

本研究采用Helper-Free系统三质粒共转染293细胞的方法成功构建rAAV载体[12,13]，获得了能有效沉默人肝癌细胞CDK2基因表达的重组病毒rAAV-shRNA-CDK2。接下来我们将通过动物体内注射将该病毒载体导入肝癌皮下移植瘤模型裸鼠，进一步研究与明确CDK2在肝癌细胞中的变化情况，并希望通过该研究能为肝癌的基因治疗提供新的有效方法。