乳腺癌易感基因1及血管内皮生长因子在食管鳞癌患者中的表达及与预后的关系

贾志阳，周志刚，李帅，王猛

郑州大学第一附属医院影像与核医学病区，郑州 450052

食管癌是中国最常见的消化道恶性肿瘤之一，2015年关于中国人群癌症发病率的统计数据表明，在过去10年中国人群食管癌发病及病死例数均呈升高和年轻化趋势，病死率在恶性肿瘤中高居第二位[1]。食管癌发病早期常难以发觉，当出现进食困难、声音嘶哑等一系列临床症状时常已发展至中晚期，总体治疗效果欠佳，因此寻找快速有效的食管癌早期诊断及预后评估生物学指标是目前的研究热点[2]。既往研究表明，多项生理及病理学因素共同参与了食管癌的发生发展过程，其中与食管癌疗效及预后关系最密切的两个生物学特征为肿瘤的浸润和转移，而肿瘤的生长及转移过程与新生血管的生成紧密相关。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）为组织血管和淋巴生成的重要调控因子，主要在大肠癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中高度表达[3]。既往研究发现，VEGF在食管癌的生长、进展和转移等过程中均发挥了重要作用，VEGF表达水平是影响患者疗效及预后的重要指标[4]。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）是一种抑癌基因，参与了DNA损伤修复、细胞周期调节及基因转录等多个过程。田云霄等[5]研究发现，BRCA1阳性表达与食管鳞癌不良预后密切相关，可能成为食管癌预后评估的新生物学指标。但目前关于VEGF、BRCA1在食管鳞癌组织中的表达及其与预后关系的研究仍较少。基于以上研究背景，本研究拟对110例食管癌患者术后标本进行VEGF和BRCA1阳性表达率检测，旨在分析VEGF和BRCA1在食管鳞癌患者中的阳性表达情况，并进一步探索二者在评估食管鳞癌患者预后中的临床价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2012年1月至2015年1月在郑州大学第一附属医院进行食管癌切除术的110例患者。纳入标准：①所有患者均经病理学检查证实为食管鳞癌；②患者术前均未行放疗、化疗或免疫治疗；③认知能力正常，同意后续随访者。排除标准：既往无其他部位肿瘤病史。110例食管鳞癌患者中，男66例，女44例；年龄为50～75岁，平均（62.18±15.50）岁。留取食管鳞癌患者的食管癌切除组织标本作为食管鳞癌组，另取相应的癌旁正常黏膜组织标本（据肿瘤5 cm以上的食管组织）作为癌旁正常黏膜组；另取58例食管高级上皮内瘤变患者的组织标本作为食管上皮内瘤变组，58例患者中男31例，女27例，年龄为55～75岁，平均（64.21±18.72）岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究方案经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，所有受试者均了解研究目的并签订知情同意书，拥有随时退出的权力。

1.2 免疫组织化学染色方法

所有组织标本均先用10%甲醛溶液固定，常规进行脱水和石蜡包埋后，4 μm厚连续切片，并行常规苏木精-伊红染色及病理学检测。

免疫组织化学染色方法：选取8张石蜡切片进行脱蜡及抗原修复，然后分别用3%H2O2和正常山羊血清封闭50 min，封闭结束后，将其中4张组织切片滴入抗VEGF特异性抗体（1∶500稀释），4℃下孵育24 h；另4张组织切片滴入抗BRCA1特异性抗体（1∶500稀释），4℃下孵育24 h；孵育完成后采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3次，滴加生物素标记的二抗，37℃下孵育40 min后，PBS连续漂洗3次（＞5 min）；滴加链霉卵白素和辣根酶标记生物素复合物，37℃下孵育40 min后，PBS连续漂洗3次（＞5 min）；滴加二氨基联苯胺显色液，常温下显色3～5 min，并用PBS替代一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

每张石蜡切片随机选取10个高倍视野，然后每视野计数200个细胞，BRCA1和VEGF阳性染色为细胞质中出现浅黄色至棕褐色颗粒，观察细胞质染色强度及阳性细胞百分比并进行计分。染色强度：未着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比：＜10%为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分；根据两项评分乘积计算总分，总分≥3分为阳性，＜3分为阴性。

1.4 随访

对患者采用电话、微信预约的方式进行门诊随访，以患者确诊为食管鳞癌的时间为起点，随访截止日期为2017年5月。

1.5 统计学分析

将实验室及随访数据录入Epidata 3.0软件建立数据库，并采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman相关性分析分析BRCA1与VEGF的相关性；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存情况的比较采用Breslow检验；影响因素分析采用Cox风险模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRCA 1、VEGF阳性表达情况的比较

食管鳞癌组组织中BRCA1、VEGF阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜组和食管上皮内瘤变组，食管上皮内瘤变组组织中BRCA1阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；癌旁正常黏膜组和食管上皮内瘤变组组织中VEGF阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同组织中BRCA1和VEGF阳性表达情况的比较[n（%）

2.2 BRCA 1与VEGF在食管鳞癌组织中表达的相关性

BRCA1与VEGF在食管鳞癌组织中阳性表达率分别为78.18%和82.73%，经Spearman相关性分析显示，BRCA1与VEGF在食管鳞癌组织中的表达呈显著正相关（r=0.341，P＜0.01）。

2.3 BRCA 1及VEGF的表达与食管鳞癌患者生存情况的关系

110例食管鳞癌患者随访时间9～60个月，中位随访时间36个月。86例BRCA1阳性表达患者中41例死亡，死亡患者生存期为9～60个月；24例BRCA1阴性表达患者中6例死亡，死亡患者生存期为12～52个月；BRCA1阴性表达患者生存情况优于阳性表达患者，差异有统计学意义（χ2=4.424，P＜0.05）（图1）。91例VEGF阳性表达患者中43例死亡，死亡患者生存期为9～60个月；19例VEGF阴性表达患者中4例死亡，死亡患者生存期为20～48个月；VEGF阴性表达患者生存情况优于阳性表达患者，差异有统计学意义（χ2=3.127，P＜0.05）（图2）。

图1 BRCA 1阳性表达（n=86）及阴性表达（n=24）食管鳞癌患者的生存曲线

图2 VEGF阳性表达（n=91）及阴性表达（n=19）食管鳞癌患者的生存曲线

2.4 BRCA 1、VEGF的表达情况与食管鳞癌临床特征的关系

不同TNM分期、分化程度及有无淋巴结转移的食管鳞癌患者BRCA1阳性表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=24.018、23.529、44.869，P＜0.05）；不同年龄、性别、浸润深度、肿瘤最大径及有无远处转移的食管鳞癌患者BRCA1阳性表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同TNM分期、分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移、远处转移的食管鳞癌患者VEGF阳性表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=7.730、19.875、6.055、8.967、12.283，P＜0.05）；不同年龄、性别及肿瘤最大径的食管鳞癌患者VEGF阳性表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 BRCA 1、VEGF的表达情况与食管鳞癌临床特征的关系

2.5 食管鳞癌患者预后影响因素的Cox风险模型分析

将患者性别、年龄、肿瘤最大径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及BRCA1、VEGF表达纳入Cox回归分析模型，单因素分析结果显示与食管鳞癌患者预后有关的因素有5个：分化程度（HR=2.342，95%CI：1.114～4.923）、淋巴结转移（HR=2.427，95%CI：1.051～5.605）、TNM分期（HR=1.536，95%CI：1.279～4.607）、BRCA1表达（HR=1.902，95%CI：1.018～3.554）和 VEGF表达（HR=2.338，95%CI：1.157～4.725）。将上述 5个因素再次纳入Cox回归分析模型，多因素分析结果显示，分化程度、淋巴结转移及VEGF表达是影响食管癌患者预后的独立危险因素（P＜0.01）。（表3）

表3 食管癌患者预后影响因素的多因素分析

3 讨论

目前，临床上食管癌的治疗手段包括手术切除、放疗、化疗及免疫治疗，但总体治疗效果欠佳[6]。流行病学研究得出，行食管癌根治术的患者5年生存率仅为36.02%，其中，治疗效果较差的主要原因是肿瘤细胞的侵袭及转移[7]。近10年来，多种生物学指标的发现对食管癌早期诊断及预后评估具有重要意义，如研究发现VEGF、BRCA1、基质金属蛋白酶家族等可成为食管癌患者早期诊断、肿瘤侵袭、远处转移及预后的预测指标，为食管癌的诊断及治疗提供更多新的思路[8]。

肿瘤细胞的增殖和转移都依赖于新生血管的生成，以提供细胞生长所必需的葡萄糖及氧气。研究证实，肿瘤患者体内存在多种血管生成因子，其中VEGF是最有效的一种，其主要通过与特异性受体相结合，诱导下游信号通路释放多种细胞因子及生长因子，进而调控新生血管的形成，促进血管内皮细胞增殖、分化和肿瘤细胞的浸润、转移。近年来多项国内外研究发现食管鳞癌组织中VEGF存在异常高表达，且与肿瘤的淋巴结转移、分化程度及浸润深度具有明显的相关性[9-10]。本研究结果提示，VEGF在食管鳞癌患者中阳性表达率为82.73%，明显高于癌旁正常黏膜组织及食管上皮内瘤变组织，表明VEGF在食管鳞癌患者的诊断中具有重要的临床价值。此外，研究还发现VEGF的表达与食管鳞癌患者TNM分期、淋巴结转移、分化程度、远处转移及浸润深度有关（P＜0.05），而与患者年龄、性别及肿瘤最大径无关（P＞0.05），这与Chen等[11]研究结果相似，其发现食管鳞癌组织中VEGF表达与TNM分期、淋巴结转移、分化程度及肿瘤组织微血管密度有关。另外，在VEGF阴性表达和阳性表达患者的长期随访中发现，VEGF阴性表达患者生存情况优于阳性表达患者，差异有统计学意义。Cox回归分析模型则发现分化程度、淋巴结转移及VEGF表达是影响食管鳞癌预后的独立危险因素。上述研究结果可能为评估食管鳞癌患者疗效及生存期提供重要的参考依据。吴旻等[12]也研究发现食管癌组织中缺氧诱导因子1α及VEGF高表达可能对放疗效果及生存预后有影响。于振涛等[13]则发现缺氧诱导因子1α能够促进VEGF基因转录，增强VEGFmRNA异常表达，从而促进肿瘤异常新生血管形成，这可能成为VEGF高表达的机制之一。

BRCA1基因是乳腺癌及卵巢癌易感基因，常被看作基因组守护者。其定位于17号染色体长臂21染色体区间，参与了DNA损伤修复、细胞周期调节及中心体复制等多个环节，对人体基因组稳定起着至关重要的作用。目前，BRCA1在乳腺癌发生发展中的作用研究较广，但在食管鳞癌患者中的表达及作用研究仍存在不足。Zhao等[14]的动物实验证实，与非食管肿瘤组织相比，食管癌组织中BRCA1蛋白表达增加，且BRCA1蛋白高表达可促进小鼠肿瘤细胞的转移，减少存活时间。另有学者临床研究发现，BRCA1蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为88.6%，且BRCA1高表达者预后较差[15]。本研究中采取免疫组织化学法检测了110例食管鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织，结果发现食管鳞癌组织中BRCA1阳性表达率可达78.18%，明显高于癌旁正常黏膜组织（26.36%）和食管上皮内瘤变组织（46.55%）。此外，还探讨了BRCA1表达与食管鳞癌临床特征的关系及对生存的影响，结果发现BRCA1阳性表达与食管鳞癌患者TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关（P＜0.05），与患者年龄、性别、远处转移、浸润深度及肿瘤最大径无关（P＞0.05），且BRCA1阴性表达患者生存情况优于阳性表达患者。这与国内外相关研究结果相似[16-17]。由此推测，BRCA1在不同类型食管黏膜组织中阳性表达率不同可能与某种机制效应导致BRCA1基因突变有关，而这种突变可能导致食管黏膜的化生甚至恶变。既往研究认为，BRCA1基因突变多发生在氨基末端的环指结构域及羧基末端的BRCT结构域，这两个功能结构域生物学上高度保守，一旦突变可导致BRCA1从细胞核到细胞质的一系列错位表达，促使BRCA1在食管癌进展中扮演类似致癌基因的角色[18]。

本研究也发现，在食管癌患者预后影响因素的Cox回归分析中，BRCA1表达并不是影响患者预后的因素，表明BRCA1可能在食管癌进展中与某些细胞因子或生长因子发挥协同或拮抗作用。经Spearman相关性分析显示，BRCA1与VEGF在食管癌组织中的表达呈显著正相关（P＜0.01），表明两者在食管癌发生发展中可能起协同作用。目前国内外关于BRCA1基因与VEGF基因的关系研究报道仍较少。Kawai等[19]发现BRCA1基因可抑制VEGF表达促进新生血管的形成，而一旦BRCA1基因失去正常表达，VEGF基因可出现异常高表达。但BRCA1参与了DNA损伤修复、转录调控、细胞凋亡等多个方面，BRCA1与VEGF在食管鳞癌中的协同作用具体与哪一个或哪些信号通路相关仍需要进一步研究。

综上所述，BRCA1和VEGF可作为食管鳞癌诊断及预后评估的有效指标，两者均参与了食管癌发生发展的复杂过程，随着两者分子生物学交互作用的进一步阐明，可能为评估食管癌生物学行为提供更多的标志物。当然，由于受到技术及研究设备的限制，本研究仍存在一些不足之处，主要是纳入样本量较小，随机误差影响较大，且未对食管癌患者治疗手段进行详细分类。故未来研究应进一步纳入更多的食管鳞癌患者并进行远期随访，同时对纳入人群进行治疗方法或年龄分层，以进一步证实BRCA1和VEGF在食管鳞癌筛查中的有效性和预后预测价值，探讨两者联合评估对食管鳞癌的诊断及预后价值。