超高效液相-飞行时间质谱法测定郫县豆瓣中的亚精胺

苟美玲，张静

(成都师范学院 化学与生命科学学院，成都 611130)

郫县豆瓣酱被誉为“川菜之魂”，以二荆条红辣椒、青皮蚕豆等为主要材料，通过自然发酵而成[1]。目前标准中虽然对郫县豆瓣的理化指标提出了规范要求，但对郫县豆瓣酱中的亚精胺含量未做相关规定。郫县豆瓣酱中的亚精胺主要来源于原料蚕豆和发酵微生物的脱羧反应[2]。亚精胺具有抗氧化、抗炎、改善线粒体代谢的功能[3]。近年来，亚精胺的抗衰老活性越来越受到人们的关注[4]。亚精胺的许多抗衰老作用与受损细胞器的降解和自噬机制的激活使细胞质材料的回收有关[5,6]。亚精胺也存在于人体内，与人类健康息息相关[7]。适量的亚精胺有益于人体健康，但当其在动物和人体内积聚达到高水平或其摄入过量时会变得具有毒性[8]，可能引起头痛、头晕、恶心、心悸等症状[9,10]，因此有必要对郫县豆瓣中亚精胺的含量进行有效检测和控制。

由于亚精胺结构中没有生色基团，既没有紫外吸收，也没有荧光及电化学活性，使得亚精胺的分离和测定都存在一定的困难，目前文献报道的测定亚精胺的方法主要有气相色谱法(GC)[11]、高效液相色谱法(HPLC)[12]、离子色谱法(IC)[13]、薄层色谱法(TLC)[14]、生物传感器法[15]、毛细管电泳法(CE)[16]等。

由于高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、柱效高、检测灵敏度高、定量分析准确等特点，国家标准GB/T 5009.208-2008和许多文献中均使用高效液相色谱法测定食品中的亚精胺含量。但是高效液相色谱法需要将目标物进行柱前或柱后衍生之后才能进行检测，因此存在衍生产物不稳定、操作复杂、反应条件苛刻、质量控制相对较难等不足，显然不适合作为郫县豆瓣酱的大量检测。因此，本文旨在建立一种简单、快速的亚精胺检测方法，适用于大批量郫县豆瓣酱中亚精胺的监控。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用10种豆瓣酱均购于成都某超市，命名为YP-1～YP-10。

亚精胺标准品：上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱级)：美国Sigma公司；甲酸(色谱级)：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

X500R飞行时间质谱仪(配有电喷雾离子源，ESI) 美国AB SCIEX公司；超高效液相色谱系统 日本SHIAMDZU公司；Heto-HSC500真空冷冻干燥机 上海佰蕾真生物科技有限公司；SB-5200 DNT超声清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；万能高速粉碎机 深圳尼嘉商贸有限公司；TD-5M离心机 四川蜀科仪器有限公司；IKA Vortex 2涡旋混匀器 德国IKA公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

分别称取50 g样品于-50 ℃真空冷冻干燥机中24 h，干燥后用万能高速粉碎机粉碎，过80目筛，然后盛装在洁净的密封袋中，备用。

称取0.5 g样品粉末于50 mL离心管中，加入20 mL色谱级乙腈，涡旋30 s，于20 ℃超声提取30 min，4000 r/min离心15 min，取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后进行质谱分析。

1.3.2 标准溶液的制备

准确称取1 mg(精确至0.00001 g)亚精胺标准品，加入10 mL乙腈溶液，配制成0.1 mg/mL的标准储备液，-20 ℃条件下保存备用。

1.3.3 超高效液相色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；柱温：30 ℃，流速：0.2 mL/min，进样量：2 μL；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液；洗脱梯度：0～3 min，20%～50% A；3～5 min，50%～100% A；5～7 min，100% A；7～10 min，100%～20% A；柱温：30 ℃，流速：0.2 mL/min，进样量：2 μL。

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(electron spray ionization，ESI)，正离子模式；喷雾气1(gas 1)：45 psi，喷雾气2(gas 2)：50 psi；气帘气(CUR)：35 psi；温度：500 ℃；离子化电压：5500 V；去簇电压(declustering potential，DP)：60 V；碰撞能量(collision energy，CE)：20 V。全扫使用Q-TOF的IDA，一级质量扫描范围m/z 50～250。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确定

2.1.1 母离子选择

以20 mg/L的亚精胺标准溶液为实验对象，在正离子扫描模式下进行母离子全扫描，扫描范围m/z 50～250，结果见图1。

由图1可知，响应强度最高的为m/z 146.1644 离子，响应强度高达1.5×106cps，由亚精胺分子式C7H19N3可知该离子为亚精胺的加氢离子，因此选择m/z146.1644离子为母离子。

2.1.2 子离子选择

以加氢离子m/z 146.1644为母离子进行二级质谱扫描，亚精胺的二级质谱图见图2，其主要产生5个碎片离子，分别为m/z 129.1386，112.1120，84.0808，72.0806，58.0651。

由图2可知，碎片离子m/z 72.0806是响应值最高的子离子，因此选择m/z 146.1649/72.0806为定量离子对，其次为m/z 112.1120，因此选择m/z 146.1649/112.1120为定性离子对。

2.1.3 MRM优化结果

由图2可知，m/z 146.1649/72.0806为定量离子对，m/z 146.1649/112.1120为定性离子对。因此以子离子m/z 72.0806和m/z 112.1120的响应强度为评价指标，对亚精胺的去簇电压及碰撞能量进行优化，结果见图3。

图1 亚精胺标准品溶液母离子扫描质谱图Fig.1 Scanning mass spectrometry of precursor ion in spermidine standard solution

图2 亚精胺标准溶液二级质谱图Fig.2 Scanning mass spectrometry of fragment ions in spermidine standard solution

图3 MRM条件优化：去簇电压(A)和碰撞能量(B)Fig.3 MRM condition optimization: declustering potential (A) and collision energy (B)

由图3A可知，碎片离子m/z 72.0806和m/z 112.1120在去簇电压为65 V时达到最大响应值。当去簇电压超过65 V时，二者的响应值均有不同程度的下降，因此选择65 V为最佳的去簇电压。由图3B可知，碎片离子m/z 72.0806和m/z 112.1120的响应强度随碰撞能量的增加而增加，当碰撞能量达到25 V时获得了最大响应值，因此选择25 V为最佳碰撞能量。

2.2 方法学研究

在本研究中，通过测定加标回收率、基质效应、检出限、定量限、精密度来验证方法的准确性。

2.2.1 方法的线性范围、检出限和定量限

将亚精胺标准储备液用乙腈稀释成5个浓度：10.0，4.0，2.0，1.0，0.5 mg/L。按优化好的实验条件进行分析，以亚精胺标准溶液的浓度(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线和相关系数R2。检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以标准溶液3∶1和10∶1进行计算，结果见表1。

表1 方法的线性参数、基质效应、检出限及定量限Table 1 Linear parameters, matrix effect, detection limits and quantification limits of the method

由表1可知，亚精胺在0.5～10 mg/mL浓度范围内线性良好，相关系数R2>0.999，检出限为0.031 mg/kg，定量限为0.121 mg/kg。

2.2.2 基质效应

在使用UPLC-MS/MS测定样品中亚精胺含量时，由于基质中不易挥发的共洗脱成分在喷雾液滴转移到气态离子的过程中会与目标分析物产生竞争关系，使得目标分析物的质谱信号增强或者减弱，从而影响实验方法的精密度、准确度[17,18]。尽管串联质谱法具有高灵敏度和高选择性，也依然不能从根本上消除基质效应[19]，因此对基质效应的研究具有重要意义。

基质匹配标准溶液是用样品提取液溶解标准品，然后用样品溶液对其进行连续稀释。本研究随机采用YP-1和YP-2作为基质效应测定的2种基质，分别用YP-1和YP-2溶解稀释亚精胺标准品，最终亚精胺浓度范围为0.55～6.25 mg/mL。

由表1可知，亚精胺在YP-1和YP-2的基质效应分别为-17.72%和-17.42%，2个样品的基质效应较为接近，其绝对值均小于20%，因此可以认为其几乎没有基质效应。可以认为，郫县豆瓣酱中的基质对亚精胺含量检测的影响不显著，因此可以直接采用标准曲线对亚精胺进行定量分析。

2.2.3 精密度与回收率

在上述优化好的条件下，在样品中添加高、中、低单个浓度的亚精胺，每个浓度平行测定6次，测定其加标回收率和精密度。精密度用相对标准偏差表示。本实验选择YP-1和YP-2测定其加标回收率和精密度，结果见表2。

表2 方法的加标回收率和精密度测定结果(n=6)Table 2 The detection results of recovery rates and precision of the method (n=6)

由表2可知，亚精胺的平均回收率在92.65%～100.58%范围内，RSD在2.01%～6.98%范围内，表明此UHPLC-Q-TOF方法的准确性和稳定性较好，可用于快速检测样品中亚精胺的含量。

2.3 样品的测定

由于红油豆瓣酱中具有较为完整的蚕豆瓣子以及较大块的辣椒皮，因此首先对样品进行匀浆均质处理，使其呈现较为均匀的酱体形态。采用上述建立的UHPLC-Q-TOF方法对10种市售品牌红油豆瓣酱中的亚精胺含量进行测定，结果见表3。

表3 10种郫县红油豆瓣酱样品中亚精胺的含量Table 3 The content of spermidine of 10 kinds of Pixian bean paste mg/kg

续 表

注：同列肩标不同字母表示差异显著(p<0.05)。

由表3可知，亚精胺含量范围为12.1～29.2 mg/kg，不同品牌红油豆瓣酱中的亚精胺含量均有显著性差异(p<0.05)，亚精胺含量最高的样品(YP-2)是含量最低的样品(YP-6)的2.4倍。豆瓣酱中亚精胺含量主要来源于原料蚕豆和发酵微生物的作用，各品牌厂家的原料来源、配比和制作工艺等因素都会影响亚精胺的含量，因此今后有必要对郫县豆瓣酱中的亚精胺含量建立质量标准。

3 结论

本实验建立了利用超高效液相色谱-飞行时间质谱串联技术快速测定郫县豆瓣酱中亚精胺含量的方法。实验以乙腈为提取溶剂，在正离子扫描模式下，采用65 V为最佳的去簇电压，25 V为最佳的碰撞能量对10种市售品牌郫县红油豆瓣酱中的亚精胺含量进行了测定，并对方法进行了系统校验。实验结果表明，亚精胺标准品在设定质量浓度范围内线性良好(R2>0.999)，加标回收率在92.65%～100.58%之间，实验重复性和仪器精密度较好。

综上所述，本实验建立的UHPLC-Q-TOF方法简单可行，可在短时间内对郫县豆瓣酱中的亚精胺进行准确的定性定量分析。