甘肃地区沙棘叶中黄酮类物质含量测定

孙国政/钱 敏/周 芸 庆阳市食品检验检测中心 甘肃 庆阳 745000

栾海波 甘肃高原圣果沙棘开发有限公司 兰州 73000

冯玉升 甘肃中商食品质量检验检测有限公司 兰州 73000

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）为胡颓子科落叶灌木或小乔木，其干燥成熟的果实为藏族、蒙古族的习用药材，具有止咳化痰、消食化滞、活血散瘀的功效[1]。除沙棘果之外，沙棘的各个部位均含有多种活性物质，而沙棘叶中的黄酮类物质含量尤其高，具有很高的经济价值，近年来陆续开发出一些功能性食品，进入了大众的生活[2]。沙棘叶中黄酮类物质具有抗心肌缺血、抗心律失常、提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗氧化、抗衰老等广泛的药理作用[3]。

沙棘作为西部防风治沙的主要经济作物，在甘肃野生和种植都很广泛，沙棘叶原料丰富，市场前景广阔。深入开发沙棘叶的经济价值，尤其是其医药方面的利用价值，则需要有简便、快捷、全面的检测分析方法，以便对沙棘叶的活性成分进行更为精准有效的分析。本研究以甘肃地区沙棘叶为研究对象，对不同产地和不同生长时期沙棘叶中黄酮类物质进行测定分析，为沙棘叶资源评价和开发提供科学数据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；UV8100D型紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科）；千分之一/万分之一天平（德国赛多利斯）。

1.2 材料与试剂

沙棘叶采集自甘肃庆阳（编号：Q）、张掖（编号：Z）、定西（编号：D）、平凉（编号：P）。

标准物质：芦丁（批号：Q4160050，纯度：99.3%， 上 海 安 普 ）； 槲 皮 素（ 批号：100081-201610，纯度： 99.1%，中国食品药品检定研究院）；山柰酚（批号：S1330010，纯度：99.1%， 上 海 安 普 ）； 杨 梅 素（ 批号：R7580010，纯度：99.8%，上海安普）；异鼠李素（批号：K4000025，纯度：99.4%，上海安普）。

其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品预处理

将采集的沙棘叶除杂，自然干燥后粉碎，过20目筛，分类编号，干燥减重法测定水分，密封装袋，0～4℃保存备用。

2.2 总黄酮含量测定

以芦丁为对照品，紫外可见分光光度计法，在500nm的波长处测定沙棘叶中总黄酮含量[1]。

2.2.1 对照品溶液的制备

准确称取经减压干燥的芦丁标准品20mg，置于50mL容量瓶中，加65%乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取25mL，置50mL容量瓶中，加65%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL含芦丁0.2mg）。

2.2.2 标准曲线的制备

准确吸取0.2mg/mL的芦丁对照品溶液0，1，2，4，6，8，10mL于 25mL比色管中，各加入65%乙醇至12.5mL，分别加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀放置5min，再加入10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀后放置 5min，再加入 1.0mol/L氢氧化钠溶液5mL，用65%乙醇溶液定容至刻度，以相应试剂做空白，放置15min后，在最大吸收波长500nm处测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见图1，直线回归方程为：Y=0.6003A+0.0202（R2=0.9994）。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取粉碎的沙棘叶2g，加入70%乙醇30mL，超声提取15min，65℃水浴回流提取1h，放冷，过滤；残渣再加入70%乙醇30mL，65℃水浴回流提取1h，放冷，过滤，合并滤液，置100mL容量瓶容中，残渣用70%乙醇洗涤，洗液并入同一容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，待测定。

2.2.4 样品测定

精密取供试品溶液10mL于25ml比色管中，加入 65% 乙醇至 12.5mL，照标准曲线制备（2.2.2项）方法，自“加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL”起，以相应试剂为空白对照，依法测定吸光值。按上述直线回归方程计算供试品溶液的浓度，利用公式：总黄酮的含量（ω%）=提取的总黄酮质量/沙棘叶粉质量×100%=CV/M×100%，即可求得各样品总黄酮的含量。结果见表1。

表1沙棘叶中总黄酮含量（单位：mg/g，干重计）Table 1 The total content of flavonoids in seabuckthorn leaves(Unit: mg/g， dry weight )

2. 3黄酮类物质的测定

2.3.1 对照品溶液制备

分别精密称取山柰素、杨梅素、槲皮素、异鼠李素各10.0mg置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，得到4种质量浓度为1000μg/mL的黄酮对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备

精密称取粉碎的沙棘叶2g，加入70%乙醇20mL，加入25%HCL溶液20mL，超声提取15min，65℃水浴回流提取1h，放冷，过滤，滤液置于100mL容量瓶容中，残渣用70%乙醇洗涤，洗液并入同一容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤即得。

2.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent C18（150mm×4.6mm，5.0μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（30:70）；流速：1.0mL/min；二级陈列检测器（370nm）；柱温：40℃；进样量：10μL。混合对照品和试样图谱见图2。

图2 沙棘黄酮类标准品（A）和供试品（B）的色谱图FIG. 2 The Chromatogram of Flavonoids standard (A)and test (B) of seabuckthorn

2.3.4 样品测定

将制备的供试品溶液（2.3.2项）注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算各样品中山奈素、杨梅素、槲皮素、异鼠李素的含量，不同产地和不同生长时期沙棘叶中黄酮含量见表2。

表2沙棘叶中黄酮类物质含量（单位：mg/g，干重计）Table 2 The content of flavonoids in seabuckthorn leaves(Unit: mg/g， dry weight )

对甘肃不同产地和不同生长时期沙棘叶中的黄酮类含量测定结果表明：由图3可以看出，各地区不同采摘月份的沙棘叶中总黄酮含量变化不明显，基本保持在一致水平。沙棘叶中总黄酮含量平均值均为35mg/g，比山西沙棘叶中总黄酮含量测定结果高出12mg [5]，他们测定的结果平均值为23mg/g。

图3 甘肃不同地区不同月份沙棘叶中总黄酮含量比较FIG. 3 The Comparison of total flavonoids in seabuckthorn leaves from different regions and growing periods in Gansu

图4 甘肃不同地区不同月份沙棘叶中黄酮类物质含量比较（注：Q、P、D、Z分别代表庆阳、平凉、定西、张掖，数字6、8分别代表采摘时间为6月份和8月份）FIG. 3 The Comparison of flavonoids in seabuckthorn leaves from different regions and growing periods in Gansu

由表2可知：沙棘叶中山奈素、槲皮素、异鼠李素、杨梅素平均含量分别为0.091 mg/g、0.16 mg/g、0.39 mg/g、0.62 mg/g，且各地区不同采摘时间沙棘叶中上述4种活性物质含量变化不明显；但从测定结果比较（见图4）发现甘肃沙棘叶中杨梅素和异鼠李素含量明显高于其他2种物质的含量高，分别是 0.62mg/g 和 0.39mg/g，研究[4][5]表明，杨梅素具有抗炎镇痛、抗肿瘤、降血糖、保肝等多种药理活性，而异鼠李素具有降血糖和血脂活性的药理作用。

3讨论

沙棘防风固沙、保持水土和改良土壤等生态效益及其果实、果油和果籽含有多种生物活性成分的经济价值已经得到大众的认可。近年研究发现，沙棘叶也含有维生素类、黄酮类、多酚类、甾醇类、多糖类有机酸等活性成分，其中黄酮类化合物含量比果实中高112.55%[6]。因此，在研究开发利用沙棘果实、果油和果籽的同时，不能忽略沙棘叶的利用研究，沙棘叶不同于沙棘果，其不受生长环境气候恶变而产量减少，资源量比沙棘果更大且易于采摘。甘肃省是沙棘资源大省，自1999年“三北”地区沙棘工作会议后，针对沙棘耐干旱、耐瘠薄，并具有防风固沙、保持水土、改良土壤等作用，把沙棘资源建设与水土保持生态环境建设精密结合起来，扩大沙棘栽植面积，目前野生沙棘加人工栽植的沙棘面积已达450万亩，主要分布在定西、庆阳、甘南、张掖、临夏、陇南、平凉、天水等地，丰富的沙棘资源为研究开发利用沙棘叶提供了便利。从本研究的测定结果来看，甘肃沙棘叶中含有丰富的杨梅素、异鼠李素等活性物质，所以有必要对沙棘叶进行深层面的研究，以更科学合理利用沙棘资源。

本研究是结合当地沙棘产业企业对沙棘叶的基础研究，在对沙棘叶中有效活性成分测定的同时，也对企业沙棘产品生产工艺改进、产品质量把关均具有积极作用。由于甘肃自然气候的限制和接到本项目时间迟的缘故，在本研究中测定项目数量还不够多，检测的项目也不够全面，在后续的研究中，我们将加强样本的采集量，拓宽对沙棘叶的研究内容，在深入测定分析沙棘叶中有效活性物质的同时，还将加大对有效活性物质提取纯化和沙棘叶保健食品的研究，全面开发利用沙棘。

本研究重在沙棘叶中有效成分测定，分析比对甘肃不同产地和不同生长时期沙棘叶中有效成分的差异，对黄酮类物质的提取、纯化工艺及检测方法的确认少有研究，而且对此方面的研究已有很多文献，故在本文中沙棘叶中黄酮类物质的提取、纯化工艺及检测方法均参考文献。