响应面法优化莜麦蛋白提取工艺

宁 芯，王国泽 ，墨紫梅，汪 磊

（1.玉林师范学院化学与食品科学学院，广西玉林 537000；2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室，广西玉林 537000；3.内蒙古科技大学生命科学与技术学院，内蒙古包头 014010；4.广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁 530001）

莜麦又称裸燕麦，起源于我国，在我国高寒地区粮食生产中占有重要地位[1]。莜麦是世界公认营养价值很高的粮种之一[2-3]，且颇具保健疗效[4-6]。随着生活水平的提高和对营养概念的不断认识，莜麦制品正日益受到人们的青睐，现已被广泛应用于食品、饲料、医药、化妆品和工业原料等领域[7-9]。

莜麦蛋白是优质的蛋白质资源，具有良好的开发前景。莜麦中蛋白质含量高达11.4%～19.9%，居禾谷类作物之首[1，10]。莜麦蛋白质是谷物中氨基酸组成最平衡的蛋白质之一，其氨基酸含量多且种类齐全，配比合理，人体利用率高，其中人体必需的8种氨基酸是小麦的2倍多，且含有较多儿童发育不可缺少的组氨酸和赖氨酸[11-12]。经常摄入莜麦食品，可以有效改善我国传统膳食引起的赖氨酸缺乏症。

蛋白质常采用碱法提取，该方法比较成熟。当前，碱法提取莜麦蛋白的研究较少，试验研究莜麦蛋白的碱法提取工艺，在单因素基础上，采用响应面法优化莜麦蛋白的提取工艺，以期为莜麦蛋白的提取和莜麦资源的加工利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莜麦（蒙燕7413），产于内蒙古武川县。

石油醚，分析纯，天津永大化学试剂有限公司提供；氢氧化钠，分析纯，天津市华东试剂厂提供；盐酸，分析纯，天津市振兴化工试剂厂提供；无水乙醇，分析纯，天津市永天化学试剂有限公司提供；牛血清蛋白，北京拜尔迪生物公司提供；考马斯亮蓝，分析纯，北京化学试剂公司提供。

DFT-200型手提式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司产品；JA5003型电子分析天平，上海越平科技仪器有限公司产品；L-550型台式低速大容量离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；PHS-3B型雷磁pH计，上海精密科学仪器有限公司产品；UV-7504型单光束紫外-可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司产品；KDN-08A型定氮仪，上海昕瑞仪器仪表有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 莜麦蛋白的提取工艺

莜麦蛋白碱提法：莜麦籽粒→磨粉→过筛→石油醚脱脂→脱脂莜麦粉→调浆→调pH值→碱法提取→过滤→提取液→含量测定。

莜麦粉碎后过100目筛，加入正己烷浸泡脱脂，脱脂后的莜麦粉干燥后粉碎得脱脂莜麦粉。精确称取5.00 g脱脂莜麦粉置于三角瓶中，按一定料液比加蒸馏水，并用1 mol/L的NaOH溶液调pH值，在一定温度下浸提一定时间，以转速3 500 r/min离心15 min，分离上清液，通过考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白质含量，并计算碱法提取莜麦蛋白的提取率。

1.2.2 莜麦蛋白提取率的计算

采用凯氏定氮法测定脱脂莜麦粉中总蛋白的含量，通过考马斯亮蓝G-250染色法测定提取液中蛋白质含量[13]。

1.2.3 统计处理

所有数据应用Excel软件、SPSS软件和Designer Expert软件进行处理和分析。其中，显著性分析采用Duncan检验，p＞0.05判定为变化不显著，p＜0.05判定为变化显著。

2 结果与分析

2.1 莜麦蛋白提取单因素试验

以莜麦蛋白提取率为指标，分别研究浸提pH值8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5；提取温度 30，35，40，45，50 ℃；提取时间 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h；料液比 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25对莜麦蛋白提取率的影响。

单因素试验见图1。

由图1可知，提取温度、浸提pH值、料液比和提取时间对莜麦蛋白提取率均有显著性影响。显著性分析结果表明浸提温度为45℃，浸提pH值9.5，料液比1∶10，提取时间1.0 h时，莜麦蛋白提取率最高。

图1 单因素试验

2.2 莜麦蛋白碱提工艺优化

在单因素试验结果的基础上，采用响应面法对莜麦蛋白碱提工艺进行优化。

Box-Behnken方案设计的因素与水平设计见表1，莜麦蛋白碱法提取工艺优化响应面试验方案与试验结果见表2。

表1 Box-Behnken方案设计的因素与水平设计

表2 莜麦蛋白碱法提取工艺优化响应面试验方案与试验结果

利用Design Expert软件对表2的数据进行多元回归拟合，得到莜麦蛋白提取率对提取温度（A）、浸提pH值（B）、料液比（C） 和提取时间（D） 的回归方程：

回归方程的方差分析见表3。

表3 回归方程的方差分析

由表3可知，模型p=0.000 1＜0.01，试验所选用的模型具有高度的显著性，失拟项p=0.056 5＞0.05不显著，决定系数R2=0.898 3，说明拟合程度良好、试验误差小，该模型可以用来预测莜麦蛋白的提取率，模型中A，C，C2极显著，B，D，D2显著。其他项系数均不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，C＞A＞B＞D，即料液比＞提取温度＞浸提pH值＞提取时间。

两因素交互作用对莜麦蛋白提取率的响应面图和等高线图见图2。

图2 两因素交互作用对莜麦蛋白提取率的响应面图和等高线图

等高线是椭圆形，则表示两因素交互作用显著；等高线是圆形则表示交互作用不显著，同时沿因素轴向等高线变化越密集，该因素对响应值影响越显著，反之越弱。根据分析结果做出响应面曲面图及等高线图。通过Design Expert软件得到莜麦蛋白碱提的最佳参数为提取温度40℃，浸提pH值9.65，料液比1∶11.66，提取时间1.15 h，预测值4.64%。对优化的条件进行验证试验，在此条件下莜麦蛋白碱提法提取率为62.02%。与理论预测值吻合，因此基于响应面法所得的优化提取参数准确可靠。

3 结论

应用响应面分析法优化莜麦蛋白碱法提取工艺，结果表明，提取温度、浸提pH值、料液比和提取时间对莜麦蛋白提取率均有显著性影响。影响莜麦蛋白碱法提取率的因素次序为料液比＞提取温度＞浸提pH值＞提取时间。碱法提取莜麦蛋白的最佳工艺参数为提取温度40℃，浸提pH值9.65，料液比1∶11.66（g∶mL），提取时间1.15 h，在此条件下莜麦蛋白的提取率为62.02%，