宠物犬体表真菌病原体初步分离与鉴定

杨晓伟，任宏彬，贾晓婷，郭素萍

（大同海关，山西 大同 037000）

真菌是自然界广泛存在的一类微生物，可引起人类和动物过敏性疾病和真菌毒素中毒症，其中寄生在人和动物体表，引起真菌性皮肤病[1]。真菌分有性生殖和无性生殖[2]。

皮肤性真菌主要寄生于人和动物表皮角质、毛发、指甲、爪、角质蛋白组织中，使局部皮肤产生组织病变[3]，甚至感染组织深部，即致病真菌侵犯皮下组织、黏膜和内脏，从而引起器官真菌感染[4]。

犬皮肤真菌病是犬类常见的临床疾病，其致病菌主要由犬小孢子菌、石膏状小孢子菌、须毛癣菌组成，其中犬小孢子菌占70%，石膏样小孢子菌为20%，须毛癣菌为10%[5]。但健康犬在皮肤防御屏障作用下病原菌无法正常生长，只是简单地粘附于皮肤或被毛之上。若外界环境发生改变，如机体抵抗力、免疫机能降低、原发性疾病或犬厮打的伤口使局部皮肤丧失保护，导致病菌侵入表皮造成感染[6]。部分学者们认为浅部真菌的发病机制多与菌丝相关。因为真菌能在毛囊口形成大量菌丝伸人毛囊，菌丝变态形成吸器，吸取营养从而大量繁殖，破坏毛囊、毛根及毛球上部的角质，并在毛内或毛周分支分裂形成紧密的孢子或分节菌丝，引起毛发病变及皮肤炎症而产生症状[7]。

随着社会的快速发展，人民生活水平日益提高，宠物（犬、猫）饲养量急剧上升，又因犬皮肤真菌病作为一种常见的人畜共患疾病，关系到人与动物的健康，故而倍受人们关注和重视。此病主要通过接触感染，临床特征主要有脱毛、瘙痒、红肿及炎症，易与其他寄生虫或细菌混合感染。

1 材料

1.1 试验材料及器材

琼脂粉（成都市科龙化工试剂厂生产）、葡萄糖（汕头市西陇化工厂有限公司生产）、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司生产）、95%酒精、蒸馏水等。

平皿、隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂生产）、封闭式调温电炉（成都川西行科工贸有限公司生产[PYX-DHS-40x50-S]）、JPT-1型架盘天平（天津市天马仪器厂生产(00000297号)、Olympus双目医用显微镜（Olympus 公司）、烘箱、高压锅、玻棒、锥形瓶、棉塞、无菌操作台、打孔器、小勺和酒精灯。

1.2 试验动物的选取

在大同爱佳宠物医院选取患真菌病的宠物犬，经伍德氏灯检查确诊患有皮肤性真菌感染。用75%酒精对宠物犬患部进行消毒，再用无菌镊子取少量患部毛发装于无菌采样袋中。

2 方法

2.1 临床症状诊断

患犬常表现为剧痒、脱屑、脱毛和结痂。毛发变脆、毛干易断、毛根易脱，皮肤上可见到红疹脱毛区覆盖着油性结痂，刮去痂皮裸露潮红或溃烂的表皮[12]。

图1 宠物犬真菌感染临床症状

2.2 毛发直接镜检

患处剪毛消毒，用手术刀在病健结合部，呈30°角单向反复刮皮肤，直至微微渗血。将病料置于载玻片上，加1滴10% KOH制片,盖上盖玻片，并在酒精灯上稍微加热后置于显微镜下镜检，观察孢子和菌丝。

2.3 伍德氏灯检查（wood’s lamp）

该技术是以特制紫外光线灯光（波长253.7 nm），通过钴或镍过滤，在感染部位检测荧光被毛来诊断皮肤癣菌病。

2.4 真菌培养与鉴定

2.4.1 制作培养基 配制沙氏葡萄糖蛋白胨培养基（Glucose Peptone Agar）又称沙堡琼脂(SDA)，按蛋白胨1 g，琼脂1.5 g，葡萄糖4 g，蒸馏水100 ml的比例配制培养基，煮沸溶解，高压115℃，灭菌20 min。趁热在无菌操作台中倒平板，待其凝固。

2.4.2 分离培养 在无菌操作台中用小镊子将采取的毛发和皮屑接种到培养基上，并编号，放入25℃恒温培养箱中，培养3～7 d，观察菌落的生长状况，在无菌操作台中对颜色不同、质地不一、形状不同的菌落进行分离纯化：打孔器打孔，小勺挑起菌落转接到新的培养基中，编号，放入25℃恒温培养箱中培养，再培养3～7 d，观察整个菌落是否已经纯化，若没有纯化还需继续分离，直到纯化菌落。

2.4.3 光镜鉴定 分离纯化的真菌培养3 d后，挑取菌落，直接制作涂片，镜检或染色后镜检，观察其显微结构，主要观察孢子和菌丝。检查是否有大、小分生孢子；大分生孢子的形状、分隔多少、孢子壁及其它特点；小分生孢子的形状、特点、排列方式等；菌丝的粗细、分枝特点、菌丝是否分隔；各种特殊菌丝(如鹿角状菌丝、球拍状菌丝、螺旋菌丝、结节菌丝、梳状菌丝等)；若宏观形态和微结构相矛盾，以微观结构为准。

2.4.4 结果判定 分离纯化后，每天定时记录菌落的生长情况：菌落的大小、菌落的直径、菌落的颜色、菌落的表面、菌落的质地、菌落的边缘、菌落的高度、培养基颜色变化、渗出物、气味等。根据菌落特征来判定皮肤真菌种类[13]。若根据以上结果还不能鉴定真菌的种类，则需借助鉴别培养基。

3 试验结果

3.1 在沙氏葡萄糖蛋白胨培养基分离培养，结合镜鉴

结果显示：犬小孢子菌、须毛癣菌、阿耶罗毛癣菌、尖端赛多孢子菌、念珠菌、共头霉、马内菲青霉、黑葡萄橞 霉、犁头霉、杂色曲霉、黄曲霉、以及鉴定到属的曲霉和暗色真菌。试验结果见图2。检； H:近平滑念珠菌培养和镜检；I:共头霉培养和镜检；J:暗色真菌培养；K:烟曲霉培养）

图2 真菌的分离与鉴定

3.2 形态特征

须毛癣菌 菌落特征：菌丝生长快，五天后长满平皿，质地疏松，边缘绒毛状，有同心圆状，表面初期呈乳白色，后期颜色加深，背面由米黄色变为土黄色再变为暗红色；显微镜特征：小分生孢子，圆形到梨形，呈簇状或未成熟的葡萄状，常存在螺旋菌丝。

阿耶罗毛癣菌 菌落特征：生长较快，一周后长满平皿，丝绒毛样生长，质地疏松，边缘呈放射状生长，表面呈米黄色，背面呈淡土黄色；显微镜特征：大分生孢子，多有分隔，长梭形，壁厚，光滑。

尖端赛多孢子菌 菌落特征：生长较快，六天后长满平皿，绒毛状生长，质地较密，边缘微绒毛，表面白色，背面由淡黄色变为黄色；显微镜特征：菌丝较粗，有分隔，分生孢子呈卵圆形。

杂色曲霉 菌落特征：生长较慢，呈粉状生长，质地疏松，边缘平整，表面颜色逐渐变色，由咖啡色→淡蓝绿色→灰色，背面为黄白色→灰白色，有散在菌落；显微镜特征：分生孢子头疏松呈放射状，分生孢子球形且有刺。

犁头霉 菌落特征：生长速度中等，纤毛状竖直生长，质地较疏松，边缘不整，短纤毛状生长，表面灰白色，背面灰白色，时间久后纤毛尖端有黑色小点；显微镜特征：大分生孢子囊，梨形，有囊托，有匍匐菌丝。

马内菲青霉 菌落特征：生长速度较慢，中间呈粉状生长，四周为纤毛状生长，质地较密，边缘平整，表面颜色为浅咖啡色→脂粉色→墨绿色→灰白色，背面中间为黄色，四周为乳黄色，有散在菌落生长；显微镜特征：无色透明分隔菌丝，分生孢子梗光滑，帚状枝双轮生，散在，少不对称，顶端狭窄。

犬小孢子菌 菌落特征：生长快速，绒毛状生长，质地较密，边缘平整，表面白色到米色，背面乳黄色到米黄色；显微镜特征：大部分为大分生孢子，梭形，纺锤形，在顶点稍有弯曲，壁厚和棘状突起。

近平滑念珠菌 菌落特征：生长很慢，形成酵母样菌落，奶油样，边缘不整，有皱褶，表面米黄色，背面乳黄色；显微镜特征：酵母细胞多呈卵圆形或长倒卵形。

共头霉 菌落特征：生长较快，绒毛状竖直向上生长，微绒毛向四周发散，边缘不整，表面灰白色，背面灰白色；显微镜特征:菌丝透明，多分枝，无分隔，孢子梗呈球形至倒卵状。

3.3 真菌生长规律

根据表1和图3，须毛癣菌、尖端赛多孢子菌、阿耶罗毛癣菌、犁头霉菌丝在5天内菌丝的长度逐渐生长延伸，其菌丝在后期不在生长。犬小孢子菌、马内菲青霉、暗色真菌、念珠菌其菌丝在10天内菌丝逐渐延伸。须毛癣菌生长速度最快，犬小孢子菌适中，念珠菌最慢。

图3 不同菌菌丝长度变化曲线

4 分析与讨论

沙氏葡萄糖蛋白胨培养基（SDA）由于具备真菌生长所必需的碳源、氮源等，适合绝大多数真菌的生长，由于SDA 培养基PH值偏酸，较低，可以抑制细菌的生长，减少培养时细菌污染的情况[14]。皮肤真菌在25℃生长培养，皮肤真菌菌落特征明显，便于观察和研究。由于患犬多数为真菌混合感染，需要多次分离与纯化。在试验过程中菌种容易变异，特别是长时间培养，多次移种等均可造成菌落颜色、质地、形态、菌体的改变，如有些菌落因培养时间过久由原来的白色变为暗红色，菌体由粉状变为绒毛状。同时要注意病原真菌对营养的要求高于一般的真菌,有些菌种更需要供给特殊的营养[15]。

毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌等引起浅部皮肤感染。资料表明，非皮肤癣菌类如念珠菌、曲霉菌等感染引起的真菌病的比例在逐渐增多[16]。浅部皮肤真菌主要侵犯含有角质的组织，如皮肤、毛发和指甲等，引起各种癣病。深部真菌，如须毛癣菌、阿耶罗毛癣菌、尖端赛多孢子菌、杂色曲霉侵犯皮肤深层和内脏，如肺、肾、脑、消化道等器官，危害非常严重[17]。宠物犬临床表现为食欲下降，呼吸困难，体表被毛易脱落，有脓性结痂和出血症状。

真菌的鉴定方法主要有直接镜检、电镜观察法、分子生物学方法，如：多聚酶链式反应(PCR)、分子杂交、随机扩增多态性分析DNA、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)、DNA序列分析(DNA sequencing)、基因芯片技术[18]。本试验采用菌落形态结合显微镜进行真菌的镜鉴，用小培养的方法来进行真菌的鉴定。该方法简单，易操作，成本不高，既可以观察菌丝的生长情况，又可以观察真菌的产孢方式，为真菌的鉴定起了一定的指导作用。但这种方法容易被污染，因此，培养的时候要注意一个菌落一个袋子的方法单独培养。

表1 真菌在一定时间内菌丝长度