北疆地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

章 莲，武 磊，高建鹏，汪骁轩，赵 鑫，齐亚银，张 莉*

（1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000；2.新疆克拉玛瑞恒畜牧开发有限责任公司，新疆 克拉玛依 834000）

副猪嗜血杆菌病（Hps）：称革拉泽氏病，可引起猪的多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等症状[1]。其致病菌为革兰氏阴性小杆菌，巴氏杆菌科嗜血杆菌属的成员。此病原菌主要危害1～4月龄的仔猪和保育猪，该病的病死率为达15%，严重感染时高达50%[2]。副猪嗜血杆菌为健康猪群的常在菌，以前多为散发[3]。随着现代规模化养殖场的不断扩大，饲养密度也随之变大，猪群的环境卫生受到了限制，副猪嗜血杆菌病的病死率有呈上升的趋势。尤其在猪群发生支原体、伪狂犬、高致病性蓝耳病、圆环病毒病等疫病时，更易引起此病的发生，给猪场造成严重的经济损失。

随着HPS病的流行，在世界各地均有报道过该病的发生[4]。目前，副猪嗜血杆菌的致病机理尚不清楚。据研究表明，强毒株可破坏鼻粘膜，进入血液，到达中枢神经系统。从而通过血脑屏障，最终造成脑膜炎的发生[5-7]。该菌主要存在于猪的上呼吸道，通过直接接触、空气和污染物传播。此外，带菌猪和慢性感染猪使得病原菌长期存在，给猪群健康带来威胁。

2018年秋季以来，北疆三个规模化猪场病猪陆续出现呼吸困难、发热、关节肿大、跛行等疑似副猪嗜血杆菌的典型症状。剖检可见，病死猪的气管内有大量泡沫样分泌物，肺脏出现典型的纤维素样病变。心脏出血，外附有一层黄白色纤维素样渗出物，心包和胸腹腔有大量积液。据了解，A场发病猪病死率为21%，B场发病猪病死率为14%，C场发病猪病死率为10%。为科学防控该病，本试验采集有HPS典型症状的病死猪肺脏、淋巴结和胸腹腔渗出液等病料，选择TSA培养基进行致病菌的分离，采用生理生化特性及基于PCR的分子特性对病原菌进行鉴定，同时对其药物敏感性进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 病死猪肺脏、胸腹腔积液、淋巴结、关节液和心包液进行分离。金黄色葡萄球菌来自本实验室分离保存。

1.1.2 主要仪器 冰箱、PCR仪、震荡培养箱、电泳仪、恒温培养箱、Bio凝胶成像仪、CO2培养箱、超净工作台。

1.1.3 主要试剂 TSB（胰蛋白大豆肉汤）、TSA（胰蛋白大豆琼脂）培养基等均购自青岛海博有限公司；生化鉴定管、NAD（v因子，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和细菌DNA提取试剂盒购自北京索莱宝公司；小牛血清购自杭州四季青生物公司。

1.1.4 药物 选用四环素、青霉素、头孢噻肟、氨苄西林、洛美沙星、环丙沙星、恩诺沙星、林可霉素、利福平、阿莫西林等共14种。

1.1.5 生化鉴定管 氧化酶、阿拉伯糖、山梨醇、脲酶、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、吲哚、麦芽糖、硝酸盐还原酶、硫化氢等14种生化培养基。

1.1.6 实验动物 5周龄健康昆明系小鼠来源于石河子大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离 无菌采集病料，用接种环将其无菌接种于TSA平板上（NAD和小牛血清），于5% CO2条件下，73 ℃培养24～36 h，镜检观察菌体形态。同时将可疑菌落接种鲜血琼脂平板。

1.2.2 染色镜检 挑取单个菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察菌落形态。

1.2.3 生化鉴定 挑取鲜血琼脂平板上的单菌落，无菌接种于生化鉴定培养基（添加NAD）中，37℃培养16～48 h后，观察培养基的颜色变化。

1.2.4 P C R检测 参照文献[8]中的特异性引物进行P C R扩增，H P S-F: 5′—GGCTTCGTCACCCTGTG— 3′；HPS-R: 5′—GTCAGAGGAAGGGTGGT— 3′；预期扩增目的片段大小为821bp。

反应体系（25ul）：上游引物 1uL，下游引物 1μL，Mix 12.5ul，ddH2O 8.5ul，模板 2ul。其反应条件为：94℃ 4 min；94 ℃ 50 s；59℃ 50 s；72℃ 50s；32个循环后；72℃ 10 min，4℃结束反应。制备1%的琼脂糖凝胶，进行电泳，成像后观察结果。

1.2.5 药敏试验 无菌吸取分离菌株的TSB纯培养物0.2 ml于TSA平板上，用高压灭菌的涂布棒将菌液涂布均匀。将药敏纸片贴于TSA平板上，37℃培养24 h后，观察抑菌圈大小。参照美国CLSI推荐的判定方法，通过测定抑菌圈直径，进行分离株对药物的敏感性分析。

1.2.6 致病性试验 将30只小鼠将其分为6组（组/5只），设一组为对照组，其余为实验组。对菌液进行细菌计数，每组实验组注射相同剂量的同一毒株菌液，分别对5组实验组小组进行腹腔注射0.2 ml/只（浓度为1×107cfu /ml）。观察小鼠的感染情况，对病死小鼠进行剖检，采集心血进行致病菌分离鉴定。

2 结果

2.1 细菌分离

将病料接种于TSA平板，培养36 h后，可见无色透明、直径为1 mm左右、圆形的单个菌落，见图1所示。结果从病料中共分离出5株疑似副猪嗜血杆菌分离株，分别编号为XJS1-2（A 场 ）、XJS3-6、XJS3-9（B场 ）、XJS7-7、XJS7-W（C场）。同时将这5株分离菌株无菌接种于TSB培养基（含0.2g/L的NAD和50mL/L的犊牛血清）中，放于震荡培养箱中37℃摇菌培养16 h后，放于4℃冰箱保存备用。

图1 细菌分离结果

2.2 染色镜检

革兰氏染色镜检，结果见图2所示。可见分离菌为革兰氏阴性菌，形态各不相同，视野内可见有长杆状、球状、短杆状的菌体，但大多数为小杆菌，少数为长杆状和球状的菌体。

图2 分离菌株镜检结果（倍数100×10）

2.3 生化试验

对不同地区HPS分离株进行生理生化鉴定。结果显示大部分分离株可发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖，不发酵D-核糖、木糖、吲哚和阿拉伯糖。硫化氢试验、脲酶、山梨醇、硝酸盐还原试验阴性，触酶阳性。分离株的生化试验结果表明这5株分离株生化试验结果符合副猪嗜血杆菌的生化特性。

表1 分离菌的生化试验结果

2.4 药敏实验

根据抑菌圈大小，对每一株分离株进行药物的敏感性试验分析，实验结果见表2所示。XJS3-6和XJS3-9对恩诺沙星最为敏感；XJS1-2对头孢噻肟最为敏感；XJS7-W对磺胺异恶唑最为敏感；XJS7-7对四环素最为敏感。

表2 部分分离菌的药敏试验结果

2.5 PCR检测结果

用细菌DNA提取试剂盒对分离菌的DNA进行提取，作为PCR扩增的模板，4℃保存备用。经PCR扩增，凝胶电泳成像后可见5株分离菌株均扩增出大小约为821 bp的片段，与目的片段相一致。

图3 PCR反应结果

M.DNA 标准DL 2000；1.阴性对照；2.XJS1-2；3. XJS3-6；4. XJS3-9；5. XJS7-W；6.XJS7-7

2.6 致病性试验

对照组小鼠均正常，实验组小鼠均出现行动缓慢，48h内，试验组XJS1-2中，有3只小鼠死亡，XJS3-6X、JS3-9组有4只小鼠死亡，实验组XJS7-W和 XJS7-7小鼠均死亡，取病死小鼠心血无菌接种于TSA中，结果分离并鉴定出副猪嗜血杆菌。

3 讨论

副猪嗜血杆菌（HPS）具有明显的宿主专一性。于1910年，Glasse首次报道该菌。1922年才首次成功分离到HPS，在临床病例中的分离率很低，仅30%左右，尤其是在死亡12h以后的病死猪组织中，很难分离成功[9]。HPS对培养的营养要求苛刻，需要v因子（NAD）和血清，在含NAD和血清的TSA平板上生长较好。研究表明，从病料中，分离该菌最好在12h之内，否则很难再分离出HPS[10]。由于在临床病料分离时，易被杂菌污染，在一定程度上阻碍了研究人员对副猪嗜血杆菌的研究。生产中，大量使用抗生素降低了该菌的分离率。

PCR技术用于临床检测，可以快速而准确地从病料中检出病原体，早在2001年，Oliveira S等[11]根据16S rDNA设计引物，并建立了HPS的PCR诊断方法，但HPS与吲哚放线杆菌16S rDNA的同源性很高[12]。本试验通过16S rDNA设计了一对特异性引物，可快速、准确的检出病原菌，避免了高同源性的缺点。

副猪嗜血杆菌具有明显的地方流行性，不同地方流行株的血清型有所不同。副猪嗜血杆菌的血清型众多，至少可将其血清型分为15个血清型，另外还有20%以上的菌株无法定型，我国流行的血清型以 1、4、5和13型为主[13]。血清型和毒力之间存在差异，不同的血清型之间很难产生交叉免疫保护[14-16]。故建议使用当地流行的分离株进行药物敏感性分析和疫苗的制备，对规模化猪场的生产用药和预防才具有实际意义。从本试验的药物敏感试验结果可看出，大部分分离菌株对喹诺酮类药物较敏感。此外，有研究者表明，金银花及其复方对副猪嗜血杆菌抑制作用明显[17]。不同地区分离菌株对药物的敏感程度有所差异，这于流行株的血清型以及猪场临床用药息息相关，使部分菌株对头孢类药物产生了耐药性。