血清LINC00626在老年直肠癌患者新辅助放化疗疗效预测中的作用研究△

杨梅，夏耀雄，江波，王羽丰，刘坤

昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院1干疗科，2放疗科，昆明 650106

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，中国直肠癌的发病率较高，并且约2/3的直肠癌患者为低位直肠癌，其中局部进展期直肠癌占所有直肠癌的2/3[1]。根据结直肠癌诊疗规范（2015版）[2]，局部进展期直肠癌患者均需先行术前新辅助放化疗，再行根治性手术治疗。指南的建议基于数项大型随机对照研究的Meta分析，但纵观这些研究，均排除年龄＞75岁的直肠癌患者[3]。考虑老年人预期生存时间与肿瘤预期生存时间的关系，目前仅推荐对老年局部进展期直肠癌患者采用个体化的放化疗方案。随着精准医学概念的提出，越来越多的研究开始探讨采用肿瘤分子标志物预测直肠癌放化疗的效果[4-8]，其中精准预测老年局部进展期直肠癌的放化疗效果和预后更为重要。

目前，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在多种肿瘤组织中差异表达，在各种肿瘤的早期诊断、疗效评价和预测预后方面已经进行了广泛的研究[5]。在结直肠癌的转移发生机制研究中，已经对生长停滞特异性转录因子5（growth arrest specific 5，GAS5）[9]和 TINCR[10]等 lncRNA 进行了初步探索，但目前尚缺乏关于局部进展期直肠癌放化疗无创性疗效预测指标（血清lncRNA）的研究。本研究首先分析老年直肠癌患者的血清lncRNA表达谱，筛选出潜在的预测新辅助放化疗效果的差异lncRNA，从中选出了长基因间非蛋白编码 RNA 626（long intergenic non-protein coding RNA 626，LINC00626），探讨LINC00626对直肠癌患者放化疗效果和预后的预测价值，最后对LINC00626的靶基因进行预测和信号通路分析，探索针对老年局部进展期直肠癌患者疗效和预后预测的新型无创肿瘤标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月就诊于昆明医科大学第三附属医院的6例老年局部进展期直肠癌患者。纳入标准：①经病理检查确诊为直肠腺癌；②年龄≥75岁；③经术前影像学评价，肿瘤临床T分期为cT3～4期和（或）淋巴结直径大于1 cm；④完成放疗联合奥沙利铂+卡培他滨（XELOX）方案化疗。排除标准：①有远处转移；②合并其他原发肿瘤或有其他恶性肿瘤史。根据实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）1.1版[11]于放疗结束后8周评估新辅助放化疗的疗效：3例反应良好[完全缓解（complete response，CR）+部分缓解（partial response，PR）]，3例反应不良[疾病稳定（stable disease，SD）+疾病进展（progressive disease，PD）]。分析反应良好与反应不良患者的血清lncRNA基因表达谱，筛选差异表达的lncRNA，其中第1位的基因为LINC00626。

根据上述纳入排除标准，进一步选取2013年2月至2014年2月就诊于昆明医科大学第三附属医院的86例老年直肠癌患者，检测其血清LINC00626水平，以3年总生存率为终点事件，运用x-tile软件分析LINC00626表达水平的最佳分组截点为LINC00626相对表达量=5.1。将86例直肠癌患者分为LINC00626高表达组（LINC00626相对表达量≥5.1）18例与LINC00626低表达组（LINC00626相对表达值＜5.1）68例。LINC00626高表达组18例患者中，男8例，女10例；平均年龄为（86.1±4.9）岁。LINC00626低表达组68例患者中，男37例，女31例；平均年龄为（86.4±4.8）岁。

1.2 治疗及疗效评价方法

所有患者均进行放疗（40～50 Gy/20～25 f）联合XELOX方案化疗（奥沙利铂130 mg/m2，d 1，卡培他滨850～1250 mg/m2，bid，d l～14）2个周期。

根据RECIST 1.1版[11]评估新辅助放化疗的疗效。CR：所有可测量的病灶消失，无新病灶出现，至少持续4周；PR：所有可测量的病灶最长径之和减少≥30%；SD：所有可测量的病灶最长径之和减少＜30%或增加＜20%；PD：所有可测量的病灶最长径之和增加≥20%，或出现新病灶。

1.3 基因筛选

1.3.1 试剂和设备主要试剂和设备包括Trizol试剂盒（购自美国Invitrogen公司）、PrimeScript RT reagent Kit试剂盒（购自日本Takara公司）、SYBR Premix ExTaqⅡKit试剂盒（购自日本Takara公司）、Agilent Human lncRNA Microarray 4×180 k芯片（购自上海欧易生物医学科技有限公司）、NanoDrop 2000分光光度计（购自美国Applied Biosystems公司）、ABI 7500实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative-polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（购自美国ABI公司）。

1.3.2 筛选过程于治疗前，清晨空腹抽取患者外周血4～5 ml加入离心管，4℃下以4000 r/min离心10 min，吸取上清液转至1.5 ml离心管中，-80℃保存。按照Trizol试剂盒说明书提取血清样本总RNA，测量RNA的浓度和纯度。当吸光度A260 nm/A280 nm为1.9～2.1时，进行lncRNA芯片检测。lncRNA芯片检测由上海欧易生物医学科技有限公司完成，共筛选出245个差异表达lncRNA，其中在反应良好患者中的上调lncRNA有107个，下调lncRNA有138个。差异表达lncRNA的标准：反应良好患者的lncRNA表达变化大于反应不良患者的1.4倍以上（P＜0.05）。选取差异表达lncRNA中排列第1位的LINC00626基因。采用FunRich软件[12]对LINC00626靶基因数据集进行信号通路分析。

1.4 qRT-PCR检测

进一步分析86例直肠癌患者的血清标本。根据PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex-TaqⅡKit试剂盒说明书进行逆转录，提取RNA后，进行qRT-PCR检测。

1.5 随访及观察指标

术后2年内，每3个月随访1次；术后第3年，每6个月随访1次。随访方式包括门诊就诊、电话随访。比较两组患者的3年总生存率，及其与老年直肠癌患者性别、临床分期、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平、肿瘤下缘与肛缘的距离、疗效的关系。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件分析数据。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank法比较两组患者的生存率。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00626表达与临床特征及疗效的关系

LINC00626表达水平与老年直肠癌患者性别、临床分期、CEA水平、肿瘤边缘与肛缘的距离无关（P＞0.05）。LINC00626高表达组患者的CR率高于LINC00626低表达组患者，差异有统计学意义（χ2=9.372，P＜0.05）。（表1）

表1 LINC00626表达与老年直肠癌患者临床特征及放化疗疗效的关系

2.2 3年总生存率的比较

LINC00626高表达组患者的3年总生存率为72.2%（13/18），明显高于LINC00626低表达组患者的30.9%（21/68），差异有统计学意义（χ2=0.318，P＜0.01）。（图1）

图1 LINC00626高表达组患者（n=18）与LINC00626低表达组患者（n=68）的生存曲线

2.3 LINC00626靶基因的信号通路分析

LINC00626靶基因主要富集于转录靶点△Np63亚型和Notch等信号通路。（图2）

图2 LINC00626靶基因的信号通路分析

3 讨论

新辅助放化疗联合全直肠系膜切除术是局部进展期直肠癌患者的标准治疗方案[2]，但目前相关的前瞻性研究均基于年龄＜75岁的患者[3]。近期研究发现，高强度的根治性治疗方案（新辅助放化疗联合全直肠系膜切除术）亦可以在老年（年龄≥70岁）直肠癌患者中获得满意的疗效，安全性良好，但总体并发症的发生率和病死率均高于年轻（年龄＜70岁）患者[13]。此外，Shan等[14]发现，直肠癌患者的年龄与放化疗的疗效相关，年龄越大，放化疗的疗效越差。这些结果提示，对适合高强度治疗方案的老年直肠癌患者进行筛选非常重要，其中术前精准地筛选适合新辅助放化疗的老年直肠癌患者更为重要。

具有预后价值的lncRNA被不断地研究，在多个肿瘤的临床研究中已有一些小样本的初步尝试[15-17]。lncRNA作为非编码RNA的一种，主要在转录后发挥作用，但其具体机制尚不明确[15]。如BRAF激活长链非编码RNA（BRAF activated long non-coding RNA，BANCR）、GAS5等lncRNA被发现与结直肠癌的淋巴结转移相关[16-17]。目前缺乏对无创（血清检测）lncRNA应用于老年直肠癌患者疗效预测的尝试。本研究首先通过对3例反应良好老年直肠癌患者和3例反应不良老年直肠癌患者的血清lncRNA表达谱进行分析，筛选出LINC00626基因后，对86例老年直肠癌患者进行进一步研究，结果显示LINC00626低表达组患者的3年总生存率为30.9%，低于LINC00626高表达组患者的72.2%，说明LINC00626具有预测预后的价值。本研究结果显示，LINC00626的表达水平与放化疗后的CR比例有关，提示LINC00626具有预测疗效的价值。

目前尚缺乏关于LINC00626在肿瘤发生发展及放化疗耐药的相关机制研究。本研究应用生物信息学方法预测LINC00626的靶基因，并分析这些靶基因所在的信号通路。结果显示，LINC00626的靶基因主要富集于转录靶点△Np63亚型和Notch等信号通路。Sun等[17]发现，Notch信号通路上的HES1蛋白可以促进上皮-间充质转化，诱导腺瘤样结肠息肉易感基因（adenomatous polyposis coli，APC）相关基因，增加对5-氟尿嘧啶的抵抗。Zhang等[18]的体外研究提示，抑制Notch1/HES1可以增加结直肠癌细胞对放疗的敏感性。而LINC00626是否可以在转录后调控Notch1/HES1信号通路进而影响老年直肠癌患者对放化疗的敏感性及影响预后，值得进一步探讨，这为临床耐药靶点的设计提供了参考。

综上所述，血清LINC00626可以作为老年局部进展期直肠癌患者新辅助放化疗疗效预测的潜在、无创的肿瘤标志物，与老年肿瘤局部进展期直肠癌患者的预后有关。